У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногистохимическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистрофин-положительные волокна. Однако, при использовании антител с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от-вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероятный механизм такого явления - возникновение второй соматической делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки считывания, вызванный основной делецией. В результате мутантный ген может транскрибироваться с образованием стабильного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин полностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клинических аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаружена также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзона 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципиальная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженерных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистрофина (14 кб) или его делетированную, но функционально активную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинантного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных (Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти очевидные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще далека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты исследователей о перспективности генной терапии МД по сравнению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клинических испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходимость обеспечения системы эффективной доставки гена дистрофина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особенно важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. Исследования по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и в нашей стране.

4.3 Гемофилия А.

Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно связан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным геном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регулирует его активность.

Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содержит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК приходится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009 нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность (150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806 п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в интроне 22 локализовано еще два других структурных гена неизвестной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в интроне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990; Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22 оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположительное место локализации бинаправленного промотора для генов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые копии гена F8A (Lakich et al.,1993).Во время процессинга первичного белкового продукта гена F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка отщепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное количество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-тивность белка сохранена, но его количество резко снижено(McGinnis et al.,1993).

Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителями мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что вероятность повторного рождения больного ребенка у них также повышена.Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 являются делециями одного или нескольких смежных экзонов. Примерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дупликации гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирована в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций локализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего большинства мутаций гена F8C характерно практически полное отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протяженных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и полностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказалось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А (Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена является гомологичная рекомбинация между идентичными последовательностями гена F8А, расположенного в интроне 22 F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII зарегистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элементов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродственного происхождения был идентифицирован инсертированный в экзоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1 последовательности представляют собой специфическое для генома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, повторяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретротранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10 F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 элемента имели открытые рамки считывания, а соответствующие реконструируемые аминокислотные последовательности были высоко идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.Таким образом, были получены еще одни косвенные подтверждения существования ряда функциональных L1 элементов, кодирующих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-зиции.Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осуществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII полиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и внегенный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).Учитывая наличие функционально активной формы белка фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо на введение в организм больного соответствующей кДНК,обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осуществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты полноценного белкового продукта. Генная терапия этого заболевания находится на стадии экспериментальных разработок . Успешно осуществлена трансдукция фибробластов человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная проблема в данном направлении заключается в выборе эффективного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длительную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возможных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом направленного мутагенеза получены трансгенные модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что клинические испытания генокоррекции этого заболевания начнутся уже в ближайшем будущем.