277900; 13q14.3-q21.1¦тирующая АТФа ¦22% в России; 1 н. дел.¦Thomas et al., 1995 ¦

ATP7B.34; ¦за P типа 1434¦H1070Gl-28%;Gl1267L 10%¦ ¦

--------------------------------------------------------------------------------------

Многим из приведенных заболеваний посвящены обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие наряду с клиническими данными специальные разделы, посвященные молекулярной природе патологического процесса, характе-ристике гена, его мутаций, их фенотипических проявлений, а так же последним достижениям и перспективам лечения, включая генную терапию. Некоторые из этих публикаций уже были упомянуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы в соответствующих подразделах этой главы. Следует так же упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моногенными болезнями, которые были исследованы молекулярными методами в нашей стране и для которых, в итоге , были разработаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна мутаций оптимальные схемы молекулярной обследования семей высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства. Практически все эти исследования проводились в рамках основных научных программ ГКНТ "Геном Человека" и "Приоритетные направления генетики". Обзор отечественных работ по молекулярной диагностике наследственных болезней представлен в ряде научных сводок (Баранов,1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов и др., 1994; Евграфов,1993).

4.1 Муковисцидоз.

Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) -самое распространенное моногенное наследственное заболевание у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь,молекулярные основы которой определены методами позиционного клонирования без использования каких-либо данных о структурных перестройках в области локализации предполагаемого гена.Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значительно облегчает его картирование и идентификацию, как это было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хромосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следующих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Баранов, Гинтер, 1994).

Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных каналов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб-раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муковисцидозе может быть полностью или частично нарушенной.К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500 мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распространенной у жителей Западной Европы и Северной Америки является мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508 положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 находится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаруживает определенный градиент распространения с севера на юг и с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до 50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро-мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является мутация W1282X (33%).Биохимический анализ клеток пациентов, больных муковисцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить определенный градиент патологических нарушений на мембранном, клеточном и организменном уровнях в зависимости от типа мутации, её локализации и структуры аномального белкового продукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что некоторые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не достигает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нарушениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х линиях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказалось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализацию и стабильность белка и снижает эффективность его функционирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993). Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обнаруживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводящих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стерта. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия,обусловленного аллельными сериями.В настоящее время в России доступны идентификации по наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом (Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты следующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно нашим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муковисцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% семей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - минисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохимическим анализом амниотической жидкости на содержание ферментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;Баранов и др.,1991).

Методами направленного мутагенеза (gene targeting см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы-яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано,что различные мутации этого гена по-разному реализуются в фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других -поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сходных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии представляют собой идеальные модели для исследования молекулярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработки и испытания терапевтических мероприятий, включая генотерапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы генотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7 центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации генноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и модельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70 пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, начатые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных культур.