4.6 Фенилкетонурия.

Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным дефектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Европе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевременном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин,умственная ограниченность, как правило, не развивается или имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скринирующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.Гидроксилирование фенилаланина является достаточно сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3 фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фермент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД,продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фенилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и сопровождаются снижением активности РАН, значительно отличаются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной фенилаланина.

PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций - однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах сплайсинга), причем часто эти мутации являются результат омтранзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется небольшой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дуплетов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район локализации делеций - экзоны 1, 2 и 3.Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сайтов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим маркерам среди представителей разных рас и этнических групп значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гаплотипами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоциирована только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рестрикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в донорном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в частности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Китае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Турции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к 9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплотипами 6, 10 и 36.Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморфным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популяциях, национальностях и этнических группах позволяет сделать вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена РАН в различных популяциях и этнических группах связано с эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз-никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с демографической историей. Несомненно доказанными являются примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие популяционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны,по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с существованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторыми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), развивающимися при хранении зерна и других продуктов(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гетерозиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность аборта, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно,высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран, способствующем росту таких грибов.В медицинской практике используется как прямая, так и косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень быстрый и эффективный метод ПЦР/StyI-диагностики cамой частой в России (более 70%) мутации R408W (Ivaschenko,Baranov, 1993; Иващенко и др., 1993). Дигностика других мажорных мутаций в PAH-гене осуществляется методами ПЦР+АСО,

аллель-специфической амплификации (ARMS), методом однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP) (см. Главу IY).При первичном обследовании семьи черезвычайно удобно использовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232,245 и 385, сцепленные в Кавказских популяциях с определенными ПДРФ-гаплотипами, а значит и со специфическими мутантными аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрикции и поэтому их аллельное состояние может быть легко протипировано с помощью амплификации и рестрикции (Kalaydjieva et al., 1991). При анализе семьи, в которой отсутствуют легко идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная диагностика может быть проведена с помощью внутригенных полиморфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Msp1-полиморфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). В последнее время появились даные о наличии высокополиморфных сайтов внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобными для молекулярного маркирования мутантных аллелей (Goltzov et al.1994).Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in vitro и в настоящее время находится на стадии экспериментальной разработки (Табл.9.2. Глава IX).

4.7 Синдром Леш-Нихана.

Синдром Леш-Нихана - рецессивное сцепленное с полом заболевание, обусловленное наследственной недостаточностью гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровождающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы.Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов,контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах клеток с образованием мРНК размером 654 п.о. Культивируемые линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и 6 тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соответствующих селективных средах. Гетерозиготные носители мутаций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных луковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молекулах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни белка, ни мРНК.