4.2 Миодистрофия Дюшенна.

Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - миодистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую – миодистрофию Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин,входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дистрофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном состоянии.

В соответствии с современными представлениями (Ahn, Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем сложной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисключающим способом. Высоко консервативные последовательности 6-и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайсируются, образуя несколько структурно различающихся форм дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифицирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являющееся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тканях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок значительно отличается от дистрофина и его уровень в некоторых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса, экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок получил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистрофин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et al., 1993).

В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаруживаются протяженные делеции, захватывающие от одного до нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух "горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализованы в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Проксимальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогенезе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4% (Passos-Bueno et al., 1992).

Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях, а также в популяциях России и стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов делетирован не только весь ген, но достаточно протяженные соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44,протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек разрыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подобного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспозонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у которого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы,размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, повторены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза нестабильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подобного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у пациентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В 2-х случаях дупликаций из 8, для которых был проведен сиквенс концевых участков, показано присутствие Alu-элементов.В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не-гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992).Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и протяженностью делеции не отмечается, но различия между формами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина может быть вовлечен также в другие структурные перестройки -дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мутации, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нуклеотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с присутствием большого количества глютаминовых триплетов, мутации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преимущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследственные формы.

Разработаны очень эффективные методы диагностики делеций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновременное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена позволяет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства делеций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопической DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амплификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование (Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген-ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотидных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малышева и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и др., 1990).

Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медико-генетического консультирования предствляют случаи, так называемого, гонадного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов)половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возникать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ранних стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ориентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случаев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оценить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери больного МД не удается определить гетерозиготное носительство, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при наличии спорадического случая рождения ребенка с МД и при отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторного рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et al.,1992).