4.4 Гемофилия B.

Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок (фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо-лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фактор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х полипептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего пептида, что позволяет ему принять конформацию активной сериновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с активацией фактора X посредством взаимодействий с ионами кальция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высокая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изолированном случае вероятность гетерозиготного носительства мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в момент рождения дочери - носительницы новой мутации, составляет около 42 лет (King et al.,1992).

К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене гемофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеотидов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы-раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встретилась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии (A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание (G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema et al., 1991).

В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофилии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяженности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5 (Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промоторной области гена F9. Именно с такими мутациями связана Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к возрасту половозрелости наступает улучшение многих клинических показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.Гемофилия B была использована как модель для выработки стратегии генетического консультирования при моногенных заболеваниях, обладающих выраженной мутационной гетерогенностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии является составление национальных баз данных молекулярных дефектов и специфических методов их диагностики. В частности,основываясь на подобной информации, авторы провели характеристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с гемофилией B шведского и английского происхождения и только в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика основана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у 60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает амплификацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection

(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации (Montadont et al.1990).Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белкового генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных биологических моделей способствовали быстрому прогрессу исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при введении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мышам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии рекомбинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свертываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологичных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный скептицизм в оценке этого достижения со стороны специалистов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофилии В - событие самого ближайшего будущего.

4.5 Болезнь Виллебранда.

Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некоторых формах рецессивное) заболевание, обусловленное наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру-ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосудов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах повреждения эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции синтеза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фактора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концентрация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.Генетически эта форма заболевания подразделяется на рецессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессивны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении скорости их выведения из плазмы (тип IIB).Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов, размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величина интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35 экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся последовательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA,повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены, кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб,соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс мутации препятствуют образованию функционального транскрипта.Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них – замены аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитарным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сегменте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях. При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофилию A, фактор Виллебранда структурно и функционально нормален, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифицируются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирующей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС (Mazurier, 1992).Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму заболевания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.Получены доказательства, что такие пациенты являются гомозиготами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 цитозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мутация была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родословной как было установлено недавно, она находилась в компаунде с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).Выбор адекватного метода молекулярной диагностики болезни Виллебранда в значительной мере предопределяется правильностью предшествующей клинической и лабораторной диагностики и результатами медико-генетического консультирования, позволяющей достаточно четко определить характер наследования заболевания в семье высокого риска и установить его форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижает эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Швеция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся (Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспективной на современном этапе представляется непрямая диагностика. В промоторной части гена, в интронах 15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 идентифицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспективным для диагностики является полиморфизм интрона 40, представляющий собой две области варьирующих по числу тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплификация этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с последующим электрофоретическим разделением позволяет идентифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма (Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволяет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому (ген) и проследить её передачу в потомстве.Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступной литературе не обнаружены.