В 15% хромосом у больных с синдромом Леш Нихана ген HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, корторые могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибридизации. Синдром Леш Нихана одно из первых моногенных наследственных заболеваний, для которых была проведена молекулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на этой моделе впервые был разработан и опробован метод анализа мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонуклеазой А в местах негомологичноно спаривания (метод расщеп-ления рибонуклеазой А - см.Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонуклеазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, половина которых - однонуклеотидные замены типа миссенс, нонсенс и в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки отдельных зкзонов и микроделеции одного или нескольких нуклеотидов. В HPRT-гене, практически, отсутствуют мутации, до-мининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключение составляет нонсенс мутация R170TER, которая составляет около 15% всех нуклеотидных замен (Gibbs et al., 1989). Также как и при гемофилиях мутации гена HPRT чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хромосомах 3, 5 и 11 (Stout, Caskey, 1984). Описаны редкие случаи синдрома Леш Нихана у гетерозиготных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается вследствие неслучайной инактивации X-хромосомы, не содержащей мутации (Ogasawara et al., 1989). Однако, у 3-х женщин -облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене, селективный тест не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фибробластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной мутацией в X-хромосоме, что и приводит к селекции клона клеток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT) X-хромосомой (Marcus et al., 1992).Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на проведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации,SSCP-анализе одноцепочечных ДНК фрагментов с их последующим секвенированием (см.Глава VI). Косвенная диагностика предусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи по- лиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 - зонд St14/TaqI).

Как мы уже отмечали (Главы VII,VIII), первая трансгенная животная модель наследственного заболевания человека,сконструированная путем направленного переноса мутациий в культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена для синдрома Леш-Нихана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,1987). На этой моделе впервые была проведена генокоррекция наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной степени связаны с существованием селективных сред, позволяющих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще,синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не только для изучения пуринового метаболизма, но и для решениямногих теоретических вопросов биологии и медицины(Seegmiller, 1989; Maraus et al., 1993; Boyel et al., 1993).Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT (или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клетки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические программы генотерапии этого заболевания на сегоднешний день отсутствуют (см.Главу IX).

4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.

Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) – гепатолентикулярная дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного медь-содержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участвующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3 формы БВК (Cox et al. , 1972). При редкой атипичной форме,предположительно Германского происхождения, у гетерозигот содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два раза. При двух других, типичных формах - славянской и ювенильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравнительно поздним началом и преимущественно неврологической симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной Европе и ведущими в этиологии заболевания являются печеночные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с поздним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в сыворотке крови больных. Ген БВК, идентифицированный в 1993г. независимо сразу в 2х лабораториях США, представляет собой медь-транспортирующую АТФазу P типа с 6-ю металл-связывающими районами. Ген имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее идентифицированным геном АТФ-азы (АТР7А), мутантном при болезни Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et al., 1993). По аналогии с геном болезни Менкеса, также обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нуклеотидной делеции в кодирующей области гена ATP7B , что доказывало его идентичность гену БВК (Petruchin et al, 1993).Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфоузлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена (6, 7, 8, 12 и 13).

Кодируемый ATP7B-геном белок содержит несколько мембранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт фосфорилирования и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сайта. В мозге, печени, почках и ломфоузлах обнаружены изоформы белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвесты. В гене АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры,а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс мутации, 15 -миссенс мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую ценность для европейцев представляют мутации His1070Gln и Gly1267Lys, зарегистрованные в 28% и 10% всех мутантных хромосом, соответственно (Thomas et al., 1995).

В заключении данного раздела представляется целесообразным кратко рассмотреть другие достаточно частые моногенные заболевания, для которых показана и проводится молекулярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других ме-дико-генетических центрах России и, прежде всего, в Лаборатории молекулярной диагностики Институтата клинической генетики РАМН (Москва).

4.9 Адрено-генитальный синдром.

Адрено-генитальный синдром - (врожденный дефицит 21-гидроксилазы) - достаточно распространенное аутосомно-рецессивное заболевание. Частота "классических" форм 1:10 000 новоржденных, "неклассической" - около 1% в популяции. В зависимости от характера нарушения функции гена и, соот ветственно клинических проявлений "классическая форма" подразделляется на два варианта: 1. летальная сольтеряющая форма; 2. нелетальная - вирилизирующая форма, связанная c избытком андрогенов (Morel, Miller, 1991).В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных 21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и псвдоген - CYP21А, неактивный вследствие делеции в 3-м экзоне, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и нонсенс мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фактор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину 3,4 кб и отличаются только по 87 нуклеотидам. Высокая степень гомологии и тандемное расположение указвают на общность эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить,что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы (называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитающих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого скота функционально активны оба гена.Белок- 21-гидроксилаза ( Р450с21- микросомальный цитохром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в 11-дезоксикортизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон. В первом случае возникает дефицит глюкокортикоидов и, прежде всего, кортизола, что в свою очередь стимулирует синтез АКТГ, и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогестерон ведет к дефициту альдостерона, что в свою очередь нарушает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к быстрой потере соли плазмой крови (соль теряющая форма). Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим геном гомологичной ДНК последовательности зачастую ведет к нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на псевдоген), либо к делеции части смыслового гена. В обоих случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций приходится около 40% мутаций, на долю конверсий - 20% и примерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечественным данным в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС,на долю конверсий приходится более 20% мутантных хромосом,на долю делеций - около 10% (Evgrafov et al., 1995).Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA A и HLA B генов,а также алелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК диагностика АГС основана на амплификакции с помощью ПЦР отдельных фрагментов генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами HaeIII или RsaI и анализе полученных фрагментов после электрофореза (Evgrafov et al., 1995).