Делеции целых экзонов или инсерции интронных областей возникают сравнительно часто в результате точковых мутаций в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга. Примерами являются мажорная в Японии сплайсинговая мутация, сопровождающаяся делецией 7-го экзона гена- PPGB, приводящая к галактосиалидозу и сплайсинговая мутация IVS2+1, обусловливающая вырезание экзона 2 гена GBA при болезни Гоше. Появление в результате точковой мутации в интронной области нового сайта сплайсинга также может сопровождаться структурными перестройками. Такова, в частности, природа 33-нуклеотидной инсерции в гене PSAP при метахроматической лейкодистрофии, обусловленной дефицитом SAP1; 24-кб инсерции в гене HEXB при болезни Зандхоффа и 5-нуклеотидной инсерции в гене IDUA при синдроме Шейе. Важно отметить, что подобные мутации совместимы с образованием небольшого числа функционально активных мРНК, следствием чего является относительно более мягкое течение соответствующих форм заболеваний.

В некоторых случаях возникновению мутаций может способствовать наличие псевдогена. Молекулярный анализ псевдогена, тесно сцепленного с геном GBA, показал, что, по крайней мере, 4 мутации, обнаруженные у пациентов с болезнью Гоше, присутствуют в норме в псевдогене. Это 2 мажорные мутации - L444P и IVS2+1 и еще 2 миссенс мутации в 10-м экзоне (A456P и V460V). Подобное сходство несомненно указывает на фундаментальную роль псевдогена в образовании мутаций в GBA-гене. В то же время само по себе присутствие псевдогена не является мутагенным фактором, особенно если сам ген и его псевдоген локализованы в разных хромосомах, как, например, в случае генов GM2A и FUCA1, псевдогены которых находятся в хромосоме 3 и в области 2q31-q32, соответственно.Для двух лизосомных болезней - фукозидоза и синдрома Гурлера, мажорными являются нонсенс мутации. Более того, при фукосидозе все известные к настоящему времени мутации приводят к полному отсутствию продукта FUCA1-гена. Так, наряду с мажорной мутацией Q351X, представленной в 20% хромосом у больных фукосидозом, описаны еще 4 нонсенс мутации и 4 делеции со сдвигом рамки считывания. При синдроме Гурлера две мажорные нонсенс мутации - W402X и Q70X, составляют около 50% всех известных мутантных аллелей гена IDUA. Кроме того,при этом заболевании зарегистрированы еще 4 минорные по частоте нонсенс мутации и 1 делеция со сдвигом рамки считывания. 3 миссенс мутации и интронная мутация, создающая дополнителный сайт сплайсинга в гене IDUA, не приводят к полному блоку синтеза идуронидазы и реализуются в виде синдрома Шейе. Уместно заметить, что оба заболевания - синдром Гурлера и синдром Шейе, являются классическим примером фенотипического разнообразия, обусловленного существованием аллельных серий . Такой спектр крайне тяжелых мутаций нельзя объяснить только повышенной частотой их возникновения. Более вероятным представляется предположение о том, что кодируемые FUCA1- и IDUA-генами белки обнаруживают определенную устойчивость к небольшим повреждениям и сохраняют функциональную активность при определенных аминокислотных заменах, то есть миссенс аллели в этих генах проявляют себя как нейтральные мутации и не приводят к развитию заболеваний.

Хорошо известно, что распространение мутаций в популяциях определяется не только, и не столько повышенной частотой их возникновения, но многими другими популяционно-генетическими факторами и, в первую очередь, связано с эффектом основателя . Типичным следствием эффекта основателя, как известно, является наличие различных мажорных по частоте мутаций одного и того же гена у пациентов разных изолятов и этнических групп. Подобная картина наблюдается, в частности, при ганглиозидозе GMI. Так, в Японии мажорными при этом заболевании являются миссенс мутации I51T и R201C,тогда как в Европе преобладают мутации R482H и W273L. Эффектом основателя можно объяснить высокую частоту аспартилглюкозаминурии в Финляндии, так как в 98% случаев у пациентов финского происхождения заболевание обусловлено присутствием одной и той же миссенс мутации C163S, резко уменьшающей активность аспартилглюкозаминидазы. Интересно отметить, что эта мутация у больных находится в сильном неравновесном сцеплении с другой миссенс мутацией в AGA-гене - R161Q, яв-ляющейся, в свою очередь, редкой формой полиморфизма. Невозможно, однако, исключить возможность комбинированного влияния этих двух мутаций на фенотип.Яркие примеры этнических различий по частоте и спектру мажорных мутаций выявляются при анализе таких лизосомных болезней накопления как болезнь Тея-Сакса, Ниманна-Пика и болезнь Гоше. Прежде всего, эти заболевания особенно распространены среди евреев-ашкенази, среди которых они встречаются в десятки раз чаще, чем в других популяциях европейского или азиатского происхождения. Наличие специфических мажорных мутаций для всех трех заболеваний у 70 - 95% всех пациентов еврейского происхождения скорее всего нельзя обьяснить только эффектом основателя. Генетический дрейф, селективное преимущество гетерозигот, характер миграции, социальные и религиозные особенности, обусловливающие ассортативность образования супружеских пар - вот те факторы, которые, по всей видимости, лежат в основе этих различий. В этой связи интересно отметить, что среди пациентов других национальностей мажорные мутации гомологичных генов, как правило, иные, чем у евреев-ашкенази. Так, болезнь Ниманна-Пика типа B часто встречается среди жителей стран, расположенных в западной части Северной Африки. Однако, в 80% случаев заболевание связано с делецией R608 в SMPD1-гене, которая не является мажорной среди евреев-ашкенази.На примере лизосомных болезней могут быть хорошо прослежены корреляции между типами мутаций и клиническими особенностями заболеваний. Выше уже упоминалось об аллельных вариантах гена IDUA, приводящих либо к синдрому Гурлера, либо к синдрому Шейе. Разные миссенс мутации в гене NAGA приводят к болезни Шиндлера или к болезни Канзаки (Табл.10.1.). Важное значение для анализа молекулярных основ патогенеза заболеваний имеют специфические мутации с поздней фенотипической манифестацией (так называемые взрослые формы).Такие мутации обнаружены в соответствующих генах при болезнях Тея-Сакса и галактосиалидозе. Очень интересен случай различного фенотипического проявления на разном расовом генетческом фоне одной и той же мутации - мажорной 16-кб делеции, обнаруживаемой у 27% пациентов с детской формой болезни Зандхоффа (McInnes et al.,1992; Sidransky et al.,1994). В частности, в одной франко-канадской семье эта мутация в компаунде с миссенс мутацией P417L, описанной впервые в Японии у пациента с подростковой формой заболевания, провлялась как взрослая форма с очень мягким течением заболевания.В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную природу совместного влияния двух аллелей одного гена на фенотип. К примеру, при некоторых форм метахроматической лейкодистрофии трудность молекулярной диагностики заболевания связана с существованем, так называемого, псевдодефицитного аллеля ARSA-гена. Этот полиморфный аллель встречается в популяциях с достаточно высокой частотой, так что гомозиготы по нему состаляют 1 - 2% всего населения. Оказалось, что псевдодефицитный аллель представляет из себя сочетание двух мутаций в цис-положении. Одна из них - 3'-концевая ругуляторная мутация в первом сайте после стоп кодона, изменяет сигнал полиаденилирования. Другая - миссенс мутация в 6-м экзоне, приводит к потере сайта N-гликозилирования. Попутно отметим, что для гена ARSA (также как и для IDUA-гена) обнаружен альтернативный сплайсинг, в результате которого в фиб-робластах и печени образуются 2 различных типа мРНК, размером 2.1 кб и 3.9 кб, соответственно. У гомозигот по псевдодефицитному аллелю в фибробластах отсутствует 2.1 кб мРНК,при этом клинических проявлений заболеваний не наблюдается.Однако, при наличии S96F мутации в ARSA-гене на фоне псевдо-дефицитного аллеля развивается тяжелая форма лейкодистрофии.В заключении раздела кратко рассмотрим состояние проблемы генокоррекции лизосомных заболеваний. В литературе отсутствуют сообщения об успешных клинических испытаниях программ генотерапевтического лечения этих заболеваний, однако, по крайней мере, для некоторых лизосомных болезней такие программы уже разработаны и утверждены . Имеются сведения о положительных результатах таких исследований на культурах мутантных клеток и на модельных животных. Так, в опытах in vitro был осуществлен успешный ретровирусный перенос нормальной кДНК гена GBA в культурах мутантных фибробластов (Sorge et al.,1987) и в культурах клеток крови пациентов с болезнью Гоше (Fink et al., 1990),в результате чего была достигнута коррекция глюкоцереброзидазной активности. Такая же коррекция метаболическоих дефектов при болезни Ниманна-Пика и при синдроме Хантера была достигнута путем введения в соответствующие мутантные линии клеток нормальных кДНК генов SMPD1 и IDS соответственно. При этом активность идуронат-2-сульфатазы после ретровирусной трансдукции in vitro оказалась существенно выше нормальной и рекомбинантный фермент активно участвовал в метаболизме глюкозамногликанов. Генокоррекция первичного биохимического дефекта при мукополисахаридозе YII (синдром Слая) была получена как in vitro, путем ретровирусного переноса нормального гена GUSB в мутантные фибробласты человека, так и in vivo на собаках и мышах. При этом у больных собак нормальный белок (бета-глюкуронидаза) не только экспрессировался, но появлялся в лизосомах и восстанавливал процессинг специфических глюкозоаминогликанов (Wolf et al., 1990). Введение этого же гена (GUSB) в мутантные стволовые клетки мышей приводило к длительной экспрессии бета-глюкуронидазы, снижению лизосомального накопления в печени и мозге и частичной коррекции болезни у трансгенных животных (Wolf et al.,1992). В другом эксперименте GUBS-кДНК вводили в культивируемые мутантные фибробласты кожи мышей и затем трансдуцированные клетки имплантировали подкожно мутантным мышам. У всех животных наблюдали экспрессию введенного гена и полное исчезновение лизосомальных отложений в печени и в мозге (Sly, 1993). Полученные результаты подтверждают принципиальную возможность лечения, по крайней мере, некоторых лизосомных болезней с помощью методов генной терапии.