Уровень мРНК КПН и активность фермента в культурах клеток способны изменяться в ответ на внешние воздействия: при смене условий освещенности [308]; под действием фактора роста нервов [144, 187, 237, 283, 335]; раствора KCl [144, 170]; бромкриптина [283]; дексаметазона [39, 300]; кортикотропин-рилизинг-фактора [253, 300]; гидрокортизона [39]. Кратковременная общая ишемия снижает, а длительная повышает активность КПН и уровень ее мРНК в гипоталамусе и коре крыс [213]. Однократный эмоционально-болевой стресс вызывает повышение карбоксипептидазно-Н-подобной активности в гипофизе и сыворотке крыс, длительный – повышение в гипофизе и снижение в сыворотке [45]. Активность КПН через 6 часов введения этанола (в дозе 4 г/кг) повышается в гипофизе и снижается в сыворотке, через 18 часов – повышается в гипофизе и сыворотке [45]. Длительное воздействие эмоционального стресса, этанола и транквилизаторов (диазепама и резерпина) повышает активность КПН в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс [341]. В некоторых отделах головного мозга крыс совместное воздействие этанола и стресса вызывает гиперактивацию КПН, причем изменение активности зависит от дозы этанола и вида стрессирующего воздействия [32]. Отмечается различие в региональной активности КПН мозга и периферических тканей у крыс с различным влечением к этанолу [54], и у мурицидных и немурицидных крыс [53]. Отмечается повышение активности КПН у немурицидных крыс при потреблении этанола и его отмене [53]. Таким образом, показано вовлечение КПН в определение агрессивности [52], в ответ на различные стрессирующие воздействия [29, 30, 49, 50, 52], введение гормонов [39] и транквилизаторов [187, 341], предрасположенности к потреблению этанола [54], в развитие физической зависимости от него [17, 44, 53].

Имеются также данные о половых отличиях в активности КПН [101]. Половые гормоны влияют на активность КПН в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системы мышей: активность фермента у контрольных животных у самок выше, чем у самцов; экзогенно вводимые тестостерон и прогестерон по-разному снижают активность КПН в тканях животных разного пола [88].

Вовлечение КПН в формирование алкогольной зависимости [17, 32, 44, 45, 53, 54, 341], его участие в процессинге многих биологически активных пептидов [35, 48, 56, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292] обусловливают интерес к исследованию активности данного фермента и его участия в формировании толерантности к этанолу и предрасположенности к алкоголизму в постнатальном периоде у животных, испытавших пренатальное воздействие этанола.

1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

Первые упоминания о существовании фермента, отщепляющего аргинин и лизин с С-конца пептидов, но в то же время отличающегося от всех известных металлокарбоксипептидаз, относятся к 1993 году. Более подробные сведения появились в 1995 году [40, 41].

Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) – экзопептидаза, отщепляющая остатки основных аминокислот с С-конца пептидов. В частности, она отщепляет остаток аргинина от дансил-Phe-Leu-Arg [40], Cbz-Gly-Gly-Arg, Met5-энкефалина-Arg6 [47] с образованием, соответственно, дансил-Phe-Leu, Cbz-Gly-Gly, Met5-энкефалина. Дальнейшего расщепления образовавшихся продуктов не происходит. Фермент имеет Mr 100000 – 110000 и проявляет максимальную активность при pH 5,0-6,0 [40]. Фенилметилсульфонилфторид и п-хлоромеркурбензоат полностью ингибируют его. Иодоацетамид снижается карбоксипептидазную активность только на 40%. Другой реагент на SH-группы (N-этилмалеимид), хелатирующий агент ЭДТА и специфический ингибитор КПН ГЭМЯК, а также ионы Co2+ не оказывают влияния на активность фермента. ФМСФ-КП инактивируется при нейтральных и слабощелочных значениях pH, но стабилизируется NaCl [40]. Km для синтетических субстратов дансил-Phe-Leu-Arg и дансил-Phe-Ala-Arg равна 48 и 96 мМ, соответственно.

ФМСФ-КП по своим физико-химическим свойствам схожа с лизосомальной карбоксипептидазой А (лизосомальная КПА, катепсин А, КФ 3. 4. 16. 1), но отличается от нее субстратной специфичностью и распределением активности в тканях и отделах мозга [127, 147, 195, 256, 257, 262, 289].

Тканевое и региональное распределение ФМСФ-КП имеет некоторые видовые отличия [38, 42, 43, 101, 102], но наибольшая активность у всех исследованных видов животных (ежа европейского, кошки, крысы, мыши) отмечена в надпочечниках и гипофизе [38, 42, 43, 88, 101, 102]. В отделах головного мозга активность ФМСФ-КП ниже, чем в периферических тканях и еще ниже, чем в гипофизе [38, 42, 43, 88]. Предполагается, что разных тканях ФМСФ-ингибируемая КП может быть представлена разными изоферментами. Поэтому выявленные отличия могут быть обусловлены разными соотношениями изоферментов у животных разных видов [43]. В мозге наибольшая активность фермента отмечается в отделах с преобладанием серого вещества (обонятельных луковицах, больших полушариях) или с высоким содержанием нейропептидов (гипоталамусе, стриатуме).

Обнаружены половые различия в активности ФМСФ-КП [41, 101, 102]. У самок активность фермента во многих тканях выше, чем у самцов [88]. Активность фермента изменяется в период полового созревания. Экзогенные тестостерон и прогестерон вызывают снижение активности ФМСФ-КП [88]. Наиболее существенное изменение активности ФМСФ-КП при введении тестостерона и прогестерона выявлено в гипофизе и половых железах у животных обоего пола. Минимальное влияние половых стероидных гормонов на активность ферментов обнаружено в гипоталамусе.

Имеющиеся данные позволяют сделать предположение о возможном участии ФМСФ-КП в процессинге, а по некоторым данным и в катаболизме [101], предшественников ряда нейропептидов [41, 43, 47, 101, 102].

Для уточнения биологической роли ФМСФ-КП в норме и при патологии интересно исследовать ее активность у пренатальной алкоголизированных животных обоего пола.

1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе

Содержание биологически активных пептидов изменяется в процессе индивидуального развития организма. Эти возрастные изменения отличаются в разных органах, тканях и группах клеток. Причем наблюдается отличие онтогенетической динамики изменения уровней разных пептидов в одной ткани и одного и того же пептида в разных тканях. Несомненно, это связано с различной биологической ролью разных пептидов в пределах одной ткани и вовлечением одного и того же пептида в протекание разных процессов в разных тканях [52, 55, 76]. В онтогенезе существенно изменяются соотношения между уровнем биологически активных пептидов и их предшественников [266], или соотношение между уровнем пептидов, происходящих из одного предшественника [181, 310], что свидетельствует об изменении специфичности процессинга предшественников в ходе индивидуального развития.

мРНК препроэнкефалина в мозге крыс обнаруживается на Е15, сохраняется на этом уровне до Р14, а затем возрастает до уровня взрослых животных [351]. Продукты расщепления проэнкефалина обнаруживаются на ранних стадиях эмбрионального развития в мозге крыс [342]. Met-энкефалин появляется в мозге крыс на Р0, его уровень увеличивается к Р21 и далее медленно возрастает [347]. По другим данным [25, 267], его уровень повышается в гипофизе, снижается в коре головного мозга, гипоталамусе и спинном мозге, не изменяется в гиппокампе и стволе мозга. Leu-энкефалин появляется в гиппокампе крыс на Р4, его содержание увеличивается к Р18, в среднем мозге не изменяется [118].