Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов,представленные в геноме уникальными последовательностями,достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан,так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последовательностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов животных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последовательности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркирующих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно генов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют наличие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клонированные ДНК из этого интервала могут быть сразу использованы для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библиотеки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из пораженных органов и тканей. При обнаружении последовательностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридизация может не дать положительных результатов.

Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным критериям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК,являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализованного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК специфическому гену. Такие доказательства могут быть получены, например, при определении нуклеотидной последовательности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последовательностью кодируемого этим геном белка. Веским доказательством в пользу правильности проведенной идентификации гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клонируемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, решающим аргументом правильности идентификации нужного гена является успешно осуществленная с его помощью генокоррекция первичного биохимического дефекта, выполненная на соответствующих культурах мутантных клеток, или получение стойкого терапевтического эффекта у трансгенных животных - биологических моделей данного наследственного заболевания.Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с геномными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта оценка имеет важное значение для реконструирования полноразмерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию гена, так как позволяет определить его границы в геномной ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и регуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последовательность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать аминокислотную последовательность соответствующего белка и таким образом определить первичное биохимическое звено в патогенезе соответствующего наследственного заболевания.

Описанный способ изучения молекулярных и биохимических основ наследственных заболеваний получил название обратной генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от белка к гену, так называемого функционального клонирования,был назван позиционным клонированием, тем более, что термин обратной генетики уже использовался ранее для обозначения метода анализа функции гена путем направленного введения в него мутаций (Collins, 1992).

Возможность использования функционального клонирования зависит от доступности информации о белковом продукте и/или о функции соответствующего гена. Для подавляющего большинства моногенных болезней определение первичного биохими-ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу из-за недостаточного понимания функционирования огромного числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделения и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохимический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их сегментов, реальные соотошения функционального и позиционного клонирования в идентификации генов, ответственных за наследственные заболевания, быстро меняются в сторону безусловного доминирования последнего.

Успех позиционного клонирования определяется возможностями картирования гена, при этом функция гена исследуется уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8 представлена общая схема позиционного клонирования, заимствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения хромосомной принадлежности картируемого гена более точная локализациия может быть установлена с помощью прицельного отбора дополнительных индексных маркеров из определенного цитогенетического сегмента. Картирование гена, определяющего наследственное заболевание, может быть значительно ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически видимой структурной перестройки в области локализации этого гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие пациенты, как правило, встречаются редко, но описание даже одного такого случая может исключить необходимость картирования гена путем последовательного анализа его сцепления с генетическими маркерами целого генома и позволит перейти непосредственно к молекулярному клонированию. Именно таким образом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных болезней.

С другой стороны, в ряде случаев удается исключить длительный процесс молекулярного клонирования, используя метод"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахождение транскрибируемых областей генома, улавливание экзоновби регуляторных участков генов, секвенирование и картирование методами гибридизации in situ большого количества анонимных кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифических библиотек, все это в комплексе приводит к значительному увеличению степени насыщенности различных сегментов хромосом известными генными последовательностями, среди которых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим линиям животных, моделирующим различные наследственные заболевания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нуклеотидных последовательностей кодирующих участков гомологичных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов позволяют успешно вести параллельные исследования геномов человека и других животных, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).Молекулярная идентификация генов открывает широкие возможности для анализа тканеспецифической регуляции их экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного анализа является генотипирование мутаций и исследование тех нарушений в структуре, локализации или в ферментативной активности соответствующих белков, которые возникают в результате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.