Техника соматической гибридизации, то есть возможность экспериментального конструирования способных к размножению межвидовых клеточных гибридов, явилась одним из наиболее мощных инструментов для нахождения связей между группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и даже их отдельными сегментами. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния культивируемых соматических клеток разных видов, в частности, клеток человека и различных грызунов - китайского хомячка, мыши, крысы (Шея,1985).

Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось,сопровождается утратой хромосом человека. Так были получены панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет однозначно определить хромосомную принадлежность соответствующих генов. Таким способом удалось локализовать более 250 аутосомных генов человека (Kao, 1983).Дальнейший прогресс в области генетического картирования в значительной степени ассоциируется с деятельностью многих научно-исследовательских центров и лабораторий по созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее,интересные и обширные родословные. Так, в Центре по Изучению Полиморфизма Человека (CEPH) (Париж, Франция) была создана уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур от всех членов семей, многоступенчатые родословные которых насчитывают многие десятки и даже сотни индивидуумов (CEPH-семьи) (Todd,1992; Weissenbach et al,1992). Перевиваемые линии клеток получали из первичных культур, трансфорированных вирусом Эпштейн-Барра, после чего такие лимфобластозные клетки становятся "бессмертными", то есть могут неограниченно долго поддерживаться в условиях культивирования. CEPH-семьи представляют собой идеальные системы для генетического анализа наследственных признаков. В результате исследования этих клеточных линий определены генотипы членов CEPH-семей одновременно по тысячам полиморфных локусов и построены соответствующие генетические карты. Кроме того, совместнымусилиями многих лабораторий мира были созданы Банки Клеточных Культур, в которых поддерживаются коллекции лимфобластозных линий клеток, полученных от членов наиболее информативных семей, в которых наблюдается сегрегация по различным наследственным признакам, в том числе по моногенным заболеваниям. Материал этих линий в виде клеточных клонов или образцов ДНК используется, в частности, для анализа сцепления сегрегирующих генов с известными генетическими маркерами или с вновь описанными полиморфными локусами. Таким образом,во многих случаях при картировании генов человека удается преодолеть ограничения, связанные с недостатком обширных информативных родословных.

Наконец, в начале 70-х годов появилась реальная возможность точной идентификации не только всех хромосом в кариотипе человека, но и их отдельных сегментов. Это связанно с появлением методов дифференциального окрашивания препаратов метафазных хромосом, которые, по сути, произвели революцию в цитогенетике и хромосомологии. Для получения дифференциальной окраски хромосомные препараты окрашивают некоторыми флюорохромами, либо, после соответствующей протеолитической обработки или нагревания, - красителем Гимза. При этом на хромосомах выявляется характерная поперечная исчерченность, так называемые бэнды, расположение которых специфично для каждой хромосомы. На метафазных хромосомах малой степени спирализации идентифицируется около 750 таких полос, на прометафазных хромосомах 2 500 - 3 000. Следовательно, величина небольших бэндов на прометафазных хромосомах примерно соответствует 1 сМ на цитогенетических картах или 1 миллиону пар оснований на физических картах. Такие ориентировочные рассчеты, как уже упоминалось, оказываются полезными при сопоставлении масштабов различных генетических карт.

Согласно официально утвержденной номенклатуре (ISCN,1971) каждая хромосома человека после дифференциальной окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых начинается от центромерного района вверх (короткое плечо -р), либо вниз (длинное плечо - q) (Рис.3.4). Полосы в каждом сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Крупные полосы зачастую подразделяются на несколько частей, соответствующих более мелким бэндам, выявляемым только при окраске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запись положения гена на цитогенетической карте включает номер хромосомы, плечо, а также номер сегмента, бэнда и его субъединицы. Например, запись 7q21.1 означает, что ген локализован в субъединице 1, 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча хромосомы 7.

Такая подробная запись особенно удобна при использовании для цитогенетического картирования метода гибридизации in situ (см.Главу I), позволяющего локализовать ген с точностью до одного бэнда и даже его субъединицы. Основу данного метода, как уже указывалось составляет гибридизация геномной ДНК целых хромосом на разных стадиях их спирализации с предварительно меченными специфическими ДНК-зондами.Источником последних могут служить геномные последовательности ДНК, сцепленные с картируемым геном, либо кДНК-овые по-следовательности. В настоящее время из тканеспецифических библиотек генов выделено около 20 000 анонимных последовательностей кДНК, представляющих более 10 000 различных генов человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют примерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Методом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000 генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с полиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирующие последовательности присутствуют на карте генов человека, но их пока нет на картах сцепления.

Раздел 3. Генетические индексные маркеры.

Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неизвестного наследственного признака (гена) в значительной степени определяется присутствием на карте фланкирующих маркеров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфических участков хромосом могут быть использованы любые локализованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем легко идентифицируемой популяционной изменчивости или полиморфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генетических маркеров производят по результатам совместного анализа их сегрегации в информативных семьях.Значительные успехи в геномном картировании были связаны с использованием в качестве генетических маркеров широко распространенной во многих популяциях изменчивости по изоферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются по специфической активности, но имеют измененную электрофоретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов обнаружил существование полиморфизма для очень многих белковых систем, контролируемых разными генами, локализованными во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были найдены генетические маркеры, с помощью которых были идентифицированы соответствующие группы сцепления.