Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенетического и молекулярного картирования прямое сопоставление этих типов физических карт практически невозможно.Одним из способов преодоления этих трудностей является конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как уже упоминалось для приготовления таких библиотек используют наборы клеточных линий соматических гибридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, механически отобранные путем проточной цитометрии. Для некоторых видов молекулярного клонирования удобнее оказались библиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.Получение таких фрагментов достигается путем целенаправленного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны мо-гут быть получены и с помощью микроманипуляций, при которых механически, под контролем микроманипулятора может быть вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по размерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеотидов (Estivill, Williamson, 1987).

Другим важным шагом на пути клонирования и анализа больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирующем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smithet al., 1987). В соответствии со стандартными методами электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разделять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит, по-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переключения направления поля. При этом более короткие молекулы легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометрическим расположением направлений полей - ортогональный,гексогональный, инверсионный. При использовании любого из этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от 50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделения фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от условий проведения электрофореза (напряжение, температура буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В качестве маркеров для определения величины больших молекул ДНК используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих специфические последовательности, также может быть осуществлен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из геля и использованы для рестрикционного картирования, построения библиотек генов и для молекулярного клонирования с целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сегментов ДНК широко используется метод клонирования в искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения библиотек генов на основе YAC-векторов.

Раздел 5. Позиционное клонирование, прогулка и прыжки по хромосоме, идентификация и изоляция генов.

Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют около 10-30 кб, варьируя в широких пределах . Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеазами, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к последовательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осуществляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получения набора фаговых или космидных клонов, содержащих относительно небольшие последовательности, насыщаяющие или полностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно,содержащий идентифицируемый ген . Затем проводят упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположением инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя одновременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью идентификации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участки генома. Для молекулярного клонирования используют различные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специфических библиотек нескольких сотен клонов с целью картирования различными методами инсертированных в них фрагментов ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализованными в заданном районе. Значительно чаще используется тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,cконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, предварительно отобранных на основании сцепления с различными ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по хромосоме."Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование (Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из определенного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с геном. После нахождения положительных клонов последние сами служат зондами для изоляции других клонов,содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким образом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получют набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных клонов носит название "контигов". С помощью физического кар-тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно установить степень перекрывания между соседними фрагментами и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны-ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким способом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК.

Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей американским исследователем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Человека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в геноме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка),не изолируя при этом все промежуточные последовательности ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переваривается редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыжку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за счет искусственного присоединения к их концам небольшого маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следовательно, и окружающие его концевые участки исходных крупных фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаговых или космидных векторах, получая библиотеку генов концевых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг клонов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах комплементарные зонду последовательности соединены маркерным геном с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сегменты ДНК также могут быть клонированы с использованием метода скользящего зондирования.Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три группы. В первой группе исследуют структурные особенности генных последовательностей. Вторая группа критериев основана на поиске функциональных участков генов. В третьем случае анализируют характер нуклеотидных последовательностей тестируемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков генов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диагностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping),промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей,а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклеотидной последовательности и сопоставлением её с присутствующими в базах данных идентифицированными генами других видов живых существ.