Совершенствование молекулярных методов анализа специфи ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большого числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сайтов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных последовательностей. Эта изменчивость также была использована для маркировки участков хромосом с целью установления более точного взаиморасположения локусов. Вскоре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10 до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хромосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно для определения хромосомной принадлежности генов, ответственных за любой тип наследственной изменчивости (Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких индексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех известных генов на основании анализа сегрегации соответствующих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для определения порядка расположения генов на хромосомах и оценки генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-номерно распределенных полиморфных маркеров.Идентификация в геноме человека большого числа полиморфных сайтов рестрикции и разработка простых методов анализа индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно повысили возможности локализации неизвестных признаков на геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000 клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типировано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени это анонимные последовательности, связь которых со специфическими генами не установлена. Их наименования чаще всего соответствуют названию отобранного из библиотеки генов клона. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая номенклатура для обозначения используемых в качестве маркеров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникальных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце номер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве генетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низкая информативность (частота гетерозигот не может превышает 50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически лишены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеатидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК последовательностей в качестве индексных генетических марке-ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома человека. В настоящее время работа по идентификации высокополиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно распределенных по хромосомам практически завершенаа(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исключением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют примерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются 90% из них оказываются полиморфными по числу копий в кластере, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В 1992г. группе французских ученых под руководством Жана Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с помощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации (C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из 814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоянием между ними около 5 сМ, получившую название Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000 фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окружающих повторы, используя для этого компьютерные программы.Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000 (C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На следующем этапе была определена хромосомная принадлежность полутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их идентификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, содержащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта сцепления индексных маркеров построена по результатам их генотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.

Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90% всего генома человека.

К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до 2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспективы широкомасштабного картирования всего генома человека стали еще более значительны. Группой английских авторов под руководством Дж.Тодда была разработана система автоматического скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих весь геном человека со средним расстоянием между соседними маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источников (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 полиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинакового молекулярного веса можно было различить на электрофореграмме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 – 9 STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-наборы были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.Только с помощью одного автоматического сканнера удается проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открывает самые широкие возможности не только для генетического картирования и создания подробных карт сцепления практически любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,она делает реальной разработку стратегии картирования генов,мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,психозы и многое другое.

Раздел 4. Хромосом-специфические библиотеки генов,пульсирующий гель-электрофорез.

Используя столь обширную систему молекулярных маркеров и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур или на материале информативных родословных можно довольно быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти непосредственно к позиционному клонированию с целью выделения и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хромосом и их фрагментов.Точность цитогенетического картирования определяется степенью спирализации хромосом, характером использованной метки и разрешающей способностью микроскопического оборудования. При картировании на стандартных метафазных хромосомах и использовании радиоактивно меченых зондов точность картирования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегментом хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50 тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,даже при такой разрешающей способности цитогенетическое картирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.Значительно более точные результаты достигаются на 2-м этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.