ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.

1 Классификация генетических карт, оценка сцепления.

Генетические карты определяют хромосомную принадлежность и взаимное расположение различных компонентов генома относительно друг друга. Возможность построения таких карт обусловлена двумя фундаментальными характеристиками генома:линейным характером локализации генов в хромосомах (это определяется линейностью молекулы ДНК) и относительной стабильностью расположения облигатных элементов генома в пределах вида. При построении генетических карт используют разные подходы. В первую очередь, к ним относятся анализ генетического сцепления на основе определения частот мейотической рекомбинации в информативных семьях и изучение особенностей насле-дования признаков, сцепленных с маркерными хромосомными перестройками. Во-вторых, исследование экспрессии генов или поиск специфических последовательностей ДНК в клеточных гибридах, содержащих лишь часть генома человека - одну или несколько хромосом или их фрагменты. В ряде случаев с этой целью используют механический сортинг целых хромосом и даже их относительно небольших участковв. Эти приемы позволяют привязать картируемый ген к определенной хромосоме и даже к определенному фрагменту хромосомы. С помощью комплекса весьма тонких методов хромосомного анализа, прежде всего, методов гибридизации in situ (см. Главу I) удается картировать отдельные гены на хромосомах человека часто с точностью до одного бэнда. И, наконец, методами молекулярного анализа осуществляют физическое картирование последовательностей ДНК, локализованных в специфических участках хромосом. Затем проводят идентификацию в этих последовательностях транскрибируемых областей, то есть генов, с последующей изоляцией и клонированием соответствующих им полноразмерных молекул кДНК. Каждый из рассмотренных этапов анализа структуры генома завершается построением карт генов, различающихся по единицам измерения расстояний между отдельными элементами этих карт, масштабам, по насыщенности или степени детализации на различных участках генома. Соответственно различают карты сцепления, генетические карты, цитогенетические карты индивидуальных хромосом и физические или молекулярные карты определенных участков ДНК. Для полной молекулярной идентификации отдельных элементов генома, то есть определения их границ, структуры и нуклеотидной последовательности, необходимо совмещение всех типов карт в местах локализации этих элементов.Первым шагом на пути построения генетических карт является формирование групп сцепления генов, контролирующих различные наследственные признаки, и исследование их взаимного расположения в этих группах. На следующем этапе определяют соответствие между генетическими группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами или их фрагментами. Цитогенетическую идентификацию хромосом проводят с использованием методов дифференциальной окраски(см.раздел 2). По мере появления все большего числа локаизованных признаков эффективность построения генетических карт значительно возрастает, так как увеличивается число маркированных участков хромосом и, таким образом, появляется возможность комбинированного использования различных экспериментальных подходов для более подробного исследова-ния этих участков.

Принципиальная схема картирования неизвестных генов,представленная на Рис.3.1, включает следующие этапы. 1. Выяснение группы сцепления; 2. Поиск ближайших фланкирующих маркеров; 3. Определение физической области (ДНК-последова-тельности), включающей искомый ген; 4. Клонирование наборфрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; 5. Выделение из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые ДНК-последовательности, предположительно соответствующие гену или его фрагменту; 6. Анализ специфических мРНК и кло-нирование кДНК-последовательности; 7. Секвенирование и идентификация самого гена (Wicking, Williamson, 1991).

Рассмотрим подробнее эту схему.

Построение карт сцепления основано на изучении процессов расхождения и рекомбинации гомологичных хромосом в мейозе. Генетические признаки, локализованные в разных хромосомах, не сцеплены друг с другом, то есть передаются от родителей детям независимо, и частота их рекомбинации (Q)составляет 0.5. Это обусловлено случайным характером расхождения гомологичных хромосом в мейозе во время редукционного деления. Гены, локализованные в одной хромосоме,рекомбинируют за счет кроссинговера, то есть за счет обмена участками гомологичных хромосом в процессе их спаривания в мейозе . При этом порядок генов не нарушается, но в потомстве могут появиться новые комбинации родительских аллелей. Вероятность кроссинговера между двумя генами зависит от расстояния между ними. Чем ближе гены расположены друг к другу, то есть чем больше они сцеплены, тем эта вероятность меньше.

Оценку сцепления между генами проводят на основании статистического анализа сегрегации признаков в семьях с разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют метод максимального правдоподобия (Kao, 1983), то есть подсчитывают десятичный логарифм шансов - lod (log of the odds), где шансы (odds) выражаются как отношение вероятности наблюдаемой родословной при условии, что два гена сцеплены (0 < Q < 0.5), к той же вероятности при отсутствии сцепления (Q = 0.5). Если значение lod > +3, гены локализованы в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная оценка соответствует максимальному значению lod. При значениях lod < -2 гены не сцеплены, то есть локализованы в разных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. Ста-тистическую обработку родословных обычно проводят с помощью компьютерных программ, наиболее известные из которых программы LIPED, CRIMAP и LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;Terwilliger, Ott, 1994). На генетических картах сцепления расстояние между генами определяется в сантиморганах (сМ).1 сМ соответствует 1% рекомбинации. Общая длина генома человека в этих единицах составляет около 3300 сМ. Сопоставляя эту величину с размером гаплоидного набора молекул ДНК,можно заключить, что 1 сМ приблизительно эквивалентен 1 миллиону пар нуклеотидов. Такие расчеты, однако, весьма приблизительны, так как частоты рекомбинации, а значит и реальная длина одного сМ, могут сильно варьировать в различных частях генома. Существуют, так называемые, горячие точки рекомбинации, также как и районы генома, где рекомбинация подавлена (центромерные и теломерные участки хромосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др.). Известно также, что частота рекомбинации у мужчин меньше, чем у женщин, так что общая длина мужского генома, измеренная в единицах рекомбинации, составляет лишь 3000 сМ. Таким образом, генетическое расстояние может дать лишь весьма ориентировочную информацию о физическом (реальном) расстоянии,выражаемом в парах нуклеотидов.

Раздел 2. Соматическая гибридизация, цитогенетический анализ, картирование анонимных последовательностей ДНК.

До начала 70-ых годов построение генетических карт человека продвигалось очень медленными темпами. Небольшой размер семей, длительный период одного поколения, ограниченное число информативных родословных и отсутствие методов эффективного цитогенетического анализа всех пар хромосом затрудняло целенаправленное картирование генов человека. Достаточно сказать, что 1-й ген человека - ген цветной слепоты был картирован на Х-хромосоме в 1911г., а 1-й аутосомный ген-только в 1968г. К 1973г. на хромосомах человека было картировано всего 64 гена, а к 1994 на генетических картах человека было локализовано уже свыше 60 000 маркерных ДНК последовательностей, в том числе около 5 000 структурных генов. Столь стремительный прогресс в картировании генов человека связан с появлением новых технологий в цитогенетике, в клеточных культурах и особенно в молекулярной генетике.