Иммуноферментный анализ.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА, The enzymelinked immunosorbent Assay, Elisa) широко используется для диагностики сифилиса. Принцип реакции заключается в соединении сифилити­ческого антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя, с антителом испытуемой сыворотки крови и выявления специфического комплекса антиген - антитело с помощью анти­видовой иммунной сыворотки, меченной ферментом. Взаимодей­ствие фермента с субстратом дает цветную реакцию, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.

В нашей стране методика постановки ИФА для серодиагностики сифилиса с отечественными ингредиентами разработана в отделе микробиологии ЦНИКВИ. При исследовании 1609 образцов сыво­ротки крови и спинномозговой жидкости выявлена чувствитель­ность, составившая 95,2%, и высокая специфичность. Отрицатель­ные результаты ИФА у полноценно леченных больных сифилисом могут служить критерием излечения (Дмитриев Г.А.). При автомати­зированном учете результатов эта реакция используется для профи­лактического освидетельствования на сифилис больших групп об­следуемых: доноров, беременных и др.

Тест для выявления IgG (Captia Syphilis G test) - тест-ловушка использует в качестве антигена очищенные патогенные трепонемы. У больных с вторичным, ранним и поздним сифилисом и нейроси-филисом и у реинфицированных пациентов чувствительность теста 100%. Тот же принцип ловушки для антител применен с целью определения сывороточных IgM (Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е.).

Метод иммуноблоттинга.

При проведении иммуноблоттинга трепонемы подвергаются элек­трофорезу с разделением белковых иммунодерминант на нитроцеллюлозе. Затем производится обработка разделенных точек исследуе­мой сыворотки и антителами к IgG либо IgM, меченными фермен­тами или радиоактивными веществами.

lgM-серология.

При изучении антителообразования в организме больных сифи­лисом установлено, что первыми после заражения вырабатываются специфические IgM, выявляемые уже на 2-й нед после заражения и достигающие максимальной концентрации в крови на 6-9 нед. Че­рез 6 мес после окончания терапии у большинства больных в крови они не определяются, На 4-й нед после инфицирования организм начинает продуцировать в достаточной степени специфические IgG. Этот вид иммуноглобулинов в наибольшем количестве определяет­ся через 1 -2 года после заражения. Заслуживает особого внимания то, что специфические IgM перестают вырабатываться при исчезно­вении из организма антигена, а секреция IgG продолжается клона­ми клеток памяти. Кроме того, крупные молекулы IgM не проходят через плаценту от матери к плоду, в связи с чем по их наличию у ребенка судят об его инфицировании бледной трепонемой.

Ввиду того, что концентрация в крови специфических IgM за­кономерно снижается после эффективного лечения, рост титра этих антител может служить вспомогательным признаком наличия реци­дива заболевания или реинфекции (В.Н.Беднова). В 1997 г. предло­жена реакция 19S IcM-FTA-ABS, а затем 19S IgM-TPHA. В основе этих тестов лежит разделение с помощью гельфильтрации испыту­емых сывороток на 19S IgM и 7IgG и выявление первых с помо­щью иммунофлюоресцентного метода и теста гемагглютгинации. Затем была предложена реакция гемадсорбции на твердофазном носителе IgM-SPHA, объединяющая элементы постановки ИФА и РПГА, а также 19SIM-SPHAH IgM-TP-ABS-ELISA. IgM-SPHA-тест наибо­лее пригоден для характеристики сифилитического процесса и в ЦНС в частности, а также отличия рецидива заболевания от реин­фекции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод заключается в многократном увеличении (амплификации) количества ДНК выявляемого микроорганизма. Разработка вариан­тов ПЦР для диагностики сифилиса обусловлена недостаточностью стандартных тестов при раннем серонегативном, врожденном сифи­лисе и нейросифилисе. ПЦР является превосходным методом для диагностики сифилиса при небольшом количестве трепонем в исследуемом материале. Большим достоинством ПЦР является воз­можность автоматизации реакции путем заданного циклического температурного режима для определяемой за счет меченных праймеров цветной реакции. Остается невыясненным вопрос - отражает ли наличие трепонемной ДНК присутствие жизнеспособных трепо-нем или это могут быть остатки погибших микроорганизмов, со­держащие способную к амплификации ДНК.

Применение ПЦР может иметь большое значение при диагнос­тике врожденного сифилиса (пассивный трансплацентарный пере­нос антител не влияет на результаты теста), нейросифилиса, пер­вичного серонегативного сифилиса (в настоящее время единствен­ным критерием является прямое микроскопическое обнаружение трепонем), а также у больных, у которых диагностика сифилиса с помощью обычных серологических реакций затруднена из-за ин-фицирования ВИЧ (Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е.).

Исследование спинномозговой жидкости.

Особое внимание уделяется исследованию спинномозговой жид­кости (ликвора) для определения пораженности сифилисом нервной системы, как критерий качества лечения у лиц с патологическими изменениями в ликворе до начала лечения и как один из критериев излеченности больных.

Спинномозговую жидкость получают при люмбальной пункции. Место прокола соответствует точке пересечения двух линий: верти­кальной (идет вдоль остистых отростков) и горизонтальной (линия Якоби). Горизонтальная линия должна соединять гребни подвздош­ных костей и проходить между остистыми отростками позвонков.

В пробирку собирают 7-8 мл (но не более 10 мл) спинномозго­вой жидкости. Это количество распределяют в две пробирки, одну из которых направляют в клиническую лабораторию, а другую - в серологическую лабораторию.

В клинической лаборатории исследуют цитоз, содержание белка, глобулиновые реакции Панди и Нонне-Апельта. Минимальные па­тологические изменения в спинномозговой жидкости следующие: содержание белка, начиная с 0,4%, цитоз - 8 клеток в 1 мкл, глобулиновые реакции (реакция Нонне - Апельта++, реакция Пан-ди+++; реакция Ланге - больше двух двоек в цифровом значении, положительная реакция Вассермана). Показатели выше указанных, даже будучи изолированными, свидетельствуют о выраженных па­тологических изменениях в спинномозговой жидкости. Патологи­ческой считается также такая спинномозговая жидкость в которой несколько показателей изменены соответственно данным минималь­ной патологии, а реакция Вассермана положительна. Концентрация белка в спинномозговой жидкости свыше 400 мг/л и число клеток в ней более 5000 на 1 л свидетельствуют о воспалительном процессе в ЦНС. Для обозначения позитивности глобулиновых реакций и РВ применяется система четырех плюсов; резко положительный результат (4+), положительный - 3+, слабоположительный - 2+ и сомни­тельный - 1+.

В серологической лаборатории ставятся реакция Вассермана, ре­акция Ланге с коллоидным золотом, РИТ, РИФ, РИФЦ (реакция иммунофлуюоресценции с цельным ликвором), а также реакция ТРНА, либо реакция FTAABS, либо реакция IgM TPHA. Отрица­тельная реакция ТРНА, либо FTAABS исключает нейросифилис. Положительная реакция IgMTPHA со спинномозговой жидкостью и индекс ТРНА свыше 10 подтверждают наличие сифилитического процесса в ЦНС. Использование РИФ также целесообразно при лик-вородиагностике сифилиса. Особенно высокочувствителен и специ­фичен тест с цельным ликвором (РИФц). РИБТ со спинномозговой жидкостью по оценке результатов аналогична таковой при исследо­вании сыворотки крови. Применение РИФ РИБТ и IgM ТРНА рас­ширяет возможности выявления сифилитического поражения не­рвной системы.