3.2.3.2 SDS - электрофорез.

SDS – электрофорез проб гидролиза проводили в присутствии додецилсульфата натрия и предварительно обработанных 3 минуты на водяной бане при 100oС с меркаптоэтанолом. В качестве маркеров использовали БСА и модифицированный in vivo фазеолин. Напряжение при электрофорезе 100 V до вхождения образцов в гель, после вхождения 200 V. По окончании электрофореза проводили фиксацию 3 раза по 20 минут на мешалке в ЭВУ. Окрашивали красителем Кумаси G-250, отмывали краситель 7% уксусной кислотой. После отмывки гели отсканировали.

3.3 Методы биоинформатики.

Расчет молекулярных масс по результатам электрофореза производился в программе Kodak Digital Science 1D, при помощи внесенных маркеров.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1 Характеристика модифицированного in vivo фазеолина.

При прорастании фазеолин подвергается воздействию эндогенных протеаз. На протяжении длительного времени в ряде экспериментов предпринимались попытки изучения и выделения ферментов эндогенного происхождения отвечающих за мобилизацию фазеолина при прорастании семян. Как упоминалось ранее, при прорастании семян распад запасных белков и в частности фазеолина происходит в семядолях. Распад начинается на 3 день прорастания семян, с образованием промежуточных фрагментов с молекулярной массой 20 – 30 кДа, при этом малая негликозилированная субъединица расщепляется первой, а большие гликозилированные субъединицы расщепляются медленнее. Основными ферментами эндогенного происхождения действующими на фазеолин во время прорастания семян фасоли являются легумаин фасоли и цистеиновая протеиназа CPPh [45, 61, 63].

Модифицированный in vivo фазеолин был выделен из 6-ти дневных проросших семян фасоли (Phaseolus Vulgaris L.) по методике Шлезира, и подвержен электрофорезу в присутствии додецилсульфата натрия. SDS - электрофорез в ПААГ показал, что модифицированный in vivo фазеолин состоит как из нерасщепленных субъединиц (с молекулярная массой в районе 40 – 49 кДа), так и из фрагментов с молекулярными массами в районе 18 – 28 кДа. Наиболее интенсивные фрагменты по массе и количеству находятся в зоне 26 – 28 кДа, которые приблизительно соответствуют модулям субъединиц фазеолина. Меньшее количество более мелких фрагментов находятся в пределах от 18 до 22 кДа. На рисунке 4 представлена фотография электрофореза модифицированного in vivo фазеолина.

M MiF

Рис. 4 SDS-электрофорез фазеолина модифицированного invivo из 6-ти дневных пророщенных семян фасоли в ПААГ.

Слева указаны стандартные молекулярные веса маркеров (кДа). Справа указаны фрагменты (F) по уменьшению молекулярного веса от F1 – 49,0 кДа до F7 – 18,0 кДа.

4.2 Гидролиз модифицированного in vivo фазеолина

папаином.

Для гидролиза модифицированного in vivo фазеолина был приготовлен комплекс ИС, содержащий 0,5 ml 2% фазеолина модифицированного in vivo в фосфат-цитратном буфере при pH 5,6 и 0,5 ml 4% папаина в присутствии ME. После 30 минутной активации папаина при 30Сo, растворы папаина и фазеолина смешиваются и процесс гидролиза начинается. Гидролиз проводили 48 часов на водяной бане при температуре 30Сo. Забор проб гидролизата производили от отметки 0`, последняя проба была взята на отметке 48h. Всего было произведено 8 проб гидролизата для SDS-электрофореза, нативного электрофореза и определения концентрации белка спектрофотометрическим методом. По результатам определения белка спектрофотометрическим методом, был построен график зависимости времени гидролиза и концентрации белка в ИС (рис. 5).

График на рис.5 отражает гидролиз фазеолина модифицированного in vivo папаином. Наиболее активно и быстро процесс происходит в течение первых 8 часов. После чего в дальнейшем не наблюдается столь активная убыль белка, особенно в промежутке времени от 24 до 48 часов. В результате гидролиза в течение 48 часов убыль белка составила 28,49%. То есть из общего 100% количества исходного белка 28,49% - составил гидролизованный белок и 71,5% - составил белок, не подвергшийся гидролизу.