Содержание.

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1 Запасные белки

2.1.2 Характеристика запасных белков

2.1.3 Характеристика фазеолина

2.2 Протеолитические ферменты

2.2.1 Общие сведения о протеолитических ферментах

2.2.2 Характеристика папаина

2.2.3 Эндогенные протеазы из проросших семян фасоли

2.2.3.1 Легумаин

2.2.3.2 Цистеиновая протеиназа СРРh

2.3 Протеолиз запасных белков

2.3.1 Механизм протеолиза запасных белков

2.3.2 Протеолиз фазеолина

2.3.3.1 Гидролиз фазеолина папаином

2.3.3.2 Протеолиз фазеолина под действием эндогенных

протеиназ

3. Материалы и методы

3.1 Выделение фазеолина

3.1.1 Выделение модифицированного in vivo фазеолина из семян фасоли

3.2 Методы исследования белка

3.2.1 Определение концентрации белка спектрофотометрическим методом

3.2.2 Гидролиз фазеолина папаином

3.2.3 Электрофорез белка в ПААГ

3.2.3.1 Нативный электрофорез

3.2.3.2 SDS - электрофорез

3.3 Методы биоинформатики

4. Результаты и их обсуждения

4.1 Характеристика модифицированного in vivo фазеолина

4.2 Гидролиз модифицированного in vivo фазеолина

папаином

4.3 Анализ процесса гидролиза фазеолина папаином

5. Выводы

6. Литература

Список сокращений.

SDS додецилсульфат натрия

Mr молекулярная масса

ПААГ полиакриламидный гель

ИС инкубационная смесь

ТХУ трихлоруксусная кислота

БФС бромфеноловый синий

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

ME меркаптоэтанол

IAC йодацетат

BSA бычий сывороточный альбумин

MiF модифицированный in vivo фазеолин

М маркер

1. Введение.

Актуальность темы. В настоящее время существует большой интерес к изучению растительных белков и в частности запасных белков семян бобовых растений. Это связано с постоянной нехваткой белковой пищи среди населения различных стран.

Питание может быть названо сбалансированным только тогда, когда содержание в нем белков и всех необходимых аминокислот соответствуют необходимому уровню, в этом плане ученые и работают над созданием таких продуктов, которые бы отвечали этим требованиям.

По данным Продовольственной и Сельскохозяйственной Организации Объединенных Наций (FAO – Food and Agriculture Organization) пищевой рацион людей в среднем включает в себя 70% белков растительного происхождения и только 30% - животного происхождения [1].

Очевидно, что белки растительного происхождения являются одним из главных источников пищи прямо или косвенно. Так при использовании растительных белков в качестве компонента кормов, для получения белка животного происхождения, потери составляют от 70% до 95%, что зависит от природы получаемого белка животного происхождения. То есть для получения одного кг. белка животного происхождения в среднем расходуется 8 кг. растительного белка [2,3].

Рациональное использование белковой пищи растительного происхождения неизбежно предусматривает изучение функциональных и биохимических свойств запасного белка.

Богатым источником растительного белка являются семена бобовых растений. Причем основная часть белка представлена именно запасными белками семян. Для изучения запасных белков семян используются такие культуры как соя (Glycine max. L.), горох (Pisum sativum L.), фасоль (Phaseolus vulgaris L.), вика (Vicia sativa) [10].

В этой связи особый интерес для изучения представляют запасные белки семян фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.). Семена данного растения содержат большое количество запасного белка фазеолина, находящегося в семядолях.

Мобилизация запасного белка при прорастании и развитии семян представляет собой регулярный процесс, представляющий собой гидролиз запасных белков семян протеиназами собственного происхождения. Понимание данного процесса может помочь, посредством методов генной инженерии, в создании новых культур растений, у которых содержание запасных белков будет отвечать необходимому уровню для питания человека с нужными аминокислотами в составе белка [4].

У фасоли большая часть запасного белка семян представлена фазеолином, что составляет 50% от общего количества белка, а также содержатся фитогемагглютинины или ликтины, составляющие 10% [6, 9,11].

В настоящее время протеолитическая модификация это самая распространенная методика по изучению свойств протеинов [5, 7, 12], а фазеолин считается моделью изучения третичной и четвертичной структуры запасного белка [8, 13].

Цель и задачи работы.

Целью работы явилось изучение и анализ влияния протеолитического фермента папаина на модифицированный in vivo фазеолин, а также сравнительный анализ протеолиза модифицированного и нативного фазеолина.

Задачи:

1) Гидролиз фазеолина папаином и анализ данного процесса.

2) Определение концентрации белка спектрофотометрическим методом.

3) Электрофорез гидролизатов в ПААГ (нативный и SDS-электрофорез).

4) Анализ результатов гидролиза по результатам электрофореза.

Объектом изучения данной работы является запасной белок семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.) – фазеолин in vivo модифицированный. Модифицированный in vivo фазеолин выделен из проросших 6-ти дневных семян фасоли.

2. Обзор литературы.

2.1 Запасные белки.

2.1.2 Характеристика запасных белков.

Белки, на ряду с углеводами и липидами, являются запасными веществами растений, которые откладываются (запасаются) на одной стадии жизненного цикла для использования на другой, метаболически более активной стадии. Они накапливаются, в основном, в специальных запасающих органах семян (эндосперме или мезофилле семядолей) при созревании семян, а также, присутствуют в небольшом количестве в зародыше [14].

Прорастание семян – важнейший этап онтогенеза растений, на котором закладываются основы их развития, устойчивости и продуктивности. Для обеспечения материальной основы этого процесса в семенах растений содержаться запасные белки. При прорастании белки используются в качестве источника азота, углерода и серы для развития зародыша. Таким образом, характерной чертой прорастания семян является мобилизация запасных веществ [23].

Запасные белки, характерные для большинства двудольных и некоторых однодольных растений, являются глобулинами. По аминокислотному составу все запасные белки выделяются по содержанию глутамата и аспарата, в значительной степени амидированных. Глобулины отличаются также высоким содержанием аргинина и низким – метионина и цистеина [14].

Запасные белки разделяются на 11 – 13S, 7 – 8S, и 2S белки в соответствии с их константами седиментации. 11S и 7S относятся к глобулинам и являются основными запасными белками большинства покрыто- и голосеменных растений, 2S белки представлены глобулинами и альбуминами. 11S и 7S белки называются также легуминами и вицилинами, соответственно, по аналогии с преобладающими запасными белками гороха (Pisum sativum L.) и кормовых бобов (Vicia faba L.) [17,18].