2.3 Протеолиз запасных белков.

2.3.1 Механизм протеолиза запасных белков.

Протеолиз - ферментативный гидролиз белков и пептидов, катализируется протеолитическими ферментами. Протеолиз может происходит по двум путям, и впервые идея об этом высказывалась в 1939 году Тизелиусом и Эриксон-Квенсель. Общая теория протеолиза разработана Линдерштрем-Лангом в 1952 году [46, 47].

Скорость расщепления пептидных связей в белках определяется характером аминокислотных остатков и структурой белка-субстрата. К аминокислотным остаткам, с которыми взаимодействует активный центр фермента, должен быть доступ. Аминокислотные остатки должны находиться на поверхности молекулы субстрата, с которой взаимодействует фермент, а также должны входить в состав подвижных и гибких участков полипептидной цепи молекулы белка, способных принять конформацию, которая будет комплементарна активному центру. Поскольку в водных растворах молекула белка может изменять конформацию, фермент будет взаимодействовать только с участками подходящей структуры. Частота подобных изменений конформации выше на гибких, структурно не упорядоченных участках полипептида, поэтому скорость протеолиза этих участках будет значительно выше. Первый этап протеолиза это расщепление пептидной связи в подвижном участке, который расположен на поверхности белковой молекулы. Дальнейший протеолиз зависит от того, как повлияет разрыв первых связей на структуру молекулы белка и протекает по двум путям [48].

Для первого типа протеолиза, названного Линдерштрем-Лангом поодиночным (кооперативным) протеолизом, характерны следующие черты. На начальных этапах происходит дестабилизация белковой молекулы, и скорость гидролиза чувствительных к действию фермента пептидных связей определяется первичной специфичностью. В течении протеолиза наблюдается исходный неизмененный белок и низкомолекулярные продукты его распада. Глубокая деградация запасных глобулинов также происходит по кооперативному типу протеолиза [49].

Второй путь, по которому может проходить протеолиз реализуется в случае, если первое расщепление в чувствительном участке молекулы белка не оказывает сильного влияния на структуру белка. Скорость действия фермента на другие чувствительные участки белка убывает в порядке снижения их чувствительности, что приводит к последовательному образованию высокомолекулярных промежуточных фрагментов. После того, как чувствительные к протеолизу связи заканчиваются, процесс протеолиза заканчивается образованием конечного высокомолекулярного продукта. Ландерштрем-Ланг назвал этот тип протеолиза последовательным (ограниченным). При ограниченном протеолизе в ИС присутствуют несколько форм продуктов реакции, один из которых может быть и коротким пептидом. Но возможно и большое присутствие продуктов реакции. При данном типе протеолиза образованные фрагменты могут удерживаться в молекуле нековалентными взаимодействиями или дисульфидными связями, а также способны отщепляться [46, 50, 51].

Оба типа протеолиза могу проходить параллельно. В таком случае протеолиз носит название смешанного. Одновременное протекание двух типов протеолиза связано с тем, что в молекуле белка подвергающемуся гидролизу помимо пептидных связей, разрыв которых не вызывает конформационных изменений, имеются связи, разрыв которых приводит к значительным изменениям структуры белка. Оба процесса способны проходить одновременно, если промежуточные продукты последовательного протеолиза будут расщепляться по кооперативному механизму протеолиза. Но при этом остальные продукты также способны расщепляться по последовательному механизму. Расщеплению по кооперативному механизму может подвергаться каждая из промежуточных форм субстрата. Существуют несколько вариантов смешанного протеолиза. Смешанный протеолиз может проходить до расщепления большей части белка. Скорость последовательного протеолиза превышает скорость кооперативного, и он завершается до окончания расщепления белка по кооперативному пути. Также может наблюдаться переход от смешанного механизма протеолиза к кооперативному типу. При значительно высокой скорости протекания протеолиза по кооперативному пути в сравнении с последовательным, может происходить почти полное поодиночное расщепление белка до завершения последовательного протеолиза [51, 52].

Критерии определения типа протеолиза – это образование или отсутствие в ИС высокомолекулярных фрагментов, которые можно обнаружить посредством SDS-электрофореза. Сложнее идентифицируется протеолиз по смешанному типу, так как обнаружение фрагментов в ИС может иметь место с одновременным протеканием протеолиза по кооперативному механизму. При протекании протеолиза по кооперативному пути молекулярная масса остается постоянной со снижением его молярной концентрации. При протекании последовательного типа протеолиза могут образовываться низкомолекулярные пептиды, причем молекулярная масса белка снижается, а молярная концентрация остается постоянной. Что касается смешанного типа протеолиза, наблюдается более медленное по сравнению с убылью белка уменьшение молекулярной массы. Но в случае, когда скорость последовательно протеолиза сильно превышает скорость поодиночного, молекулярная масса белка уменьшается пропорционально убыли белка. При смешанном типе протеолиза молекулярная масса остаточного белка может оставаться неизменной в том случае, если последовательный протеолиз происходит без отщепления низкомолекулярных пептидных фрагментов [49, 51, 52, 56].

2.3.2 Протеолиз фазеолина.

2.3.3.1 Гидролиз фазеолина папаином.

Характерная особенность запасного белка семян фазеолина – это устойчивость к глубокому протеолизу. В экспериментах с различными протеазами не было получено полной деградации фазеолина. Процесс гидролиза обычно завершается на стадии ограниченного протеолиза. Фазеолин значительно отличается от других 7S белков по характеру протеолиза. Так глобулиновая фракция семян фасоли (соответствующая в основном фазеолину) практически не гидролизуется рядом ферментов: трипсином, пепсином, и некоторыми другими протеазами, в том числе и папаином [53, 54].

Была установлена небольшая гидролизуемость фазеолина. Причиной ограниченного протеолиза фазеолина является жесткость структуры большей части его молекулы, полный гидролиз которой достигается только после глубокой денатурации [59, 62].

Исследования действия папина на фазеолин показали, что фазеолин не подвергается глубокому гидролизу. В то же время фазеолин, прогретый в течение 15 минут при 99oС, гидролизуется быстро и полностью, так как при термической обработке происходят конформационные изменения молекулы фазеолина. Папаин расщепляет субъединицы фазеолина в участке расположенном в центре полипептидных цепей. Существует связь протеолиза фазеолина и конформационных изменений в молекуле, происходящих при термической обработке фазеолина. Прогрев фазеолина в течение 10 минут, не приводит к заметным изменениям его вторичной структуры. Результат разрушения третичной и четвертичной структуры (благодаря экспонированию большинства ароматических аминокислотных остатков к водному растворителю) приводит к кратному увеличению поверхностной гидрофобности молекулы. Причина увеличения гидролизуемости термически обработанного фазеолина – необратимые нарушения третичной и четвертичной структуры его молекулы [45, 60, 33].