Особенности третичной и четвертичной структуры фазеолина придают ему устойчивость к протеолизу. У фазеолина практически все остатки тирозина и триптофана находятся внутри молекулы, что указывает на ее более компактную конформацию. Плотно упакованная молекула характеризуется относительно жесткой и стабильной структурой. Агрегация мономеров фазеолина в триммер также является необходимым условием его устойчивости к протеолизу [57, 58].

2.3.3.2 Протеолиз фазеолина под действием эндогенных

протеиназ.

При прорастании семян и росте проростков происходит распад запасных белков внутри запасных органелл. Этот процесс обычно инициируется вновь синтезированными эндопептидазами, но возможно и участие пептидаз сохраненных при созревании семян. Образованные при действии эндопептидаз олигопептиды подвергаются дальнейшему расщеплению. Продукты распада в конечном итоге деградируют до свободных аминокислот, которые используются для синтеза белков.

Распад запасного белка фазеолина эндогенными протеиназами начинается при прорастании семян фасоли. Процесс начинается в аксиальной части проростка и затем происходит в семядолях. Распад фазеолина под действием эндогенных протеиназ начинается на третий день прорастания семян. При этом образуются промежуточные фрагменты белка с молекулярной массой 20 – 30 кДа. На восьмой день прорастания семян исходные цепи фазеолина отсутствуют, а на десятый день исчезают и промежуточные фрагменты. Малая негликозилированная субъединица расщепляется первой (на четвертый день прорастания она уже не обнаруживается), а большие гликозилированные субъединицы расщепляются медленнее [45, 61, 63].

Существуют ряд эндогенных протеиназ отвечающих за протеолиз фазеолина при прорастании семян. Так из 5-дневных проростков фасоли была выделена папаиноподобная цистеиновая протеиназа CPPh и изучено ее действие на фазеолин. Динамика активности данной протеазы при прорастании семян корректирует с динамикой распада фазеолина. При этом молекулярная масса фазеолина снижается с 140 до 120 кДа. Образуется ряд фрагментов с молекулярной массой 20 – 30 кДа. Данная протеаза расщепляет каждую субъединицу фазеолина только пополам. CPPh ограниченно гидролизует фазеолин, при этом убыль белка составляет не более 10%. Существует также папаиноподобная протеаза А фасоли, которая как и CPPh катализирует только ограниченный протеолиз фазеолина. Другая эндогенная протеаза – легумаин фасоли LLP расщепляет молекулу фазеолина примерно пополам, образуя близкие по подвижности фрагменты (в ДСН–ПААГ). LLP действует медленнее чем CPPh. LLP играет инициирующую роль в процессе деградации фазеолина при прорастании семян, модифицируя фазеолин путем ограниченного протеолиза. Конформационные изменения молекулы фазеолина, возникшие в результате действия LLP, приводят к тому, что другие протеазы способны атаковать фазеолин [66, 64].

3. Материалы и методы.

Для исследования использовался запасной белок семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.) – фазеолин in vivo модифицированный. Модифицированный in vivo фазеолин выделен из проросших 6-ти дневных семян фасоли.

3.1 Выделение фазеолина.

3.1.1 Выделение модифицированного invivo фазеолина из семян фасоли.

Выделение модифицированного in vivo фазеолина проводили из проросших 6-ти дневных семян фасоли по Шлезиру [65].

Проросшие семена очищали от оболочки и зародыша. Полученные семядоли растирали до однородной массы. Полученную массу растворяли 74% сульфатом аммония в отношении 1 к 10, то есть на 50 г. белковой смеси 500 мл. раствора сульфата аммония. Смесь перемешивали в течение часа при комнатной температуре, затем центрифугировали в течение 30 минут при 6 000 оборотах. После центрифугирования суспензии, отделяли надосадочную жидкость и доводили до 100% насыщения сульфатом аммония. Затем раствор центрифугировали 40 минут при 10oС, при 6 000 оборотах. Осажденный белок растворяли в небольшом количестве воды (70 – 80 мл.), доводили pH раствора до 4,5–5 разбавленным HCl и подвергали диализу. Диализ проводили против воды до 12 часов 3 раза в холодильнике. Осажденный белок после диализа центрифугировали при 6 000 оборотах 40 минут при 10oС. После чего осадок перерастворили в воде и довели pH до 7,5. Затем раствор лиофилизировали. Экстракция белка проводилась в присутствии комплекса ингибиторов для предотвращения неконтролируемого протеолиза.

3.2 Методы исследования белка.

3.2.1 Определение концентрации белка спектрофотометрическим методом.

Концентрацию белка определяли спектрофото- метрическим методом, по Гофману.

Хроматографическая бумага размечается на 24 квадрата, размер каждого 2 на 2 см. Пробы ИС наносятся на бумагу по 5 µl на квадрат хроматографической бумаги в трех повторностях. После этого бумага высушивается в сушильном шкафе при температуре 110oС в течение 3 минут. Осаждали белок в 6% ТХУ и затем белок окрашивали 0,05% раствором БФС в 5% ТХУ. Избыток красителя отмывали в 2% уксусной кислоте 3 раза па 10 минут. Затем бумагу нарезали и окрашенный белок экстрагировали в присутствии 0,01 N раствора NaOH, содержащим 0,01 N EDTA замедляющий разложение красителя до 45 минут, и определяли концентрацию белка спектрофотометрическим методом при длине волны 591 нм.

3.2.2 Гидролиз фазеолина папаином.

Гидролиз модифицированного in vivo фазеолина из 6-ти дневных проросших семян фасоли под действием фермента папаина проводили в течение 48 часов на водяной бане при 30oС. Активация папина проводилась 30 минут при 30oС, на 200 mg (10,5 µl) папаина приходится 487 µl буфера и 2,5 µl МЕ, в результате получаем 500 µl 0,04% папаин. После активации папина вносим 500 µl 2% раствора фазеолина в фосфат- цитратном буфере и добавляем 3,75 µl МЕ. В установленное время опыта (0`,15`,30`, 60`, 120`, 4h, 48h) производился отбор проб инкубационной смеси для SDS- и нативного электрофореза и определения концентрации белка спектрофотометрическим методом.

3.2.3 Электрофорез белка в ПААГ.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле – метод разделения смесей белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью (длины полипептидной цепочки или молекулярной мессы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов).

3.2.3.1 Нативный электрофорез.

Для нативного электрофореза брали пробы гидролиза собранные ранее, содержащие 15 µl гидролизата и 1,5 µl IAC. Приготовили образцы для внесения в гель следующим образом: 15 µl образца, 4 µl трис-боратного буфера (pH 8,4), 0,3 µl 0,5% БФС, 1 капля глицерина. Электрофорез проводили в градиенте ПААГ 4 – 30%, при напряжении тока 150 V (70 V до вхождения образцов в гель). В качестве маркеров использовали исходный фазеолин, молекулярная масса которого 140 кДА и BSA с молекулярной массой 64 кДа. Окрашивали гель красителем Кумаси. Отмывку геля производили на мешалке обесцвечивающим раствором. После отмывки – результаты электрофореза отсканировали.