Необходимость более достоверного результата количественного определения привела к использованию инструментальных методов.

Метод элюирования. Этот метод заключается в том, что разделенное вещество смывают с сорбента растворителем и определяют его концентрацию уже другими методами - фотометрическими, полярографическими и т.д. Это достаточно точный метод, но только при условии количественного выделения разделенного вещества. Из-за высокой трудоемкости метод используется достаточно редко и неприемлем при большом количестве исследуемых образцов.

Фотографический метод определения заключается в фотографировании пластинок с разделенным веществом и дальнейшим определением степени почернения, с использованием десинтометров.

Радиографический метод аналогичен фотометрическому, только с той разницей, что определяется почернение пластинки, вызванное излучением разделенного вещества. Этот метод используется только при определении веществ с мечеными атомами.

Фотодесинтометрический метод может быть использован без выделения вещества с пластинки и основан на определении не только площади пятна, но и его интенсивности.

Это наиболее точный метод определения концентрации веществ, так как позволяет при использовании калибровочных графиков, проводить достаточно точные количественные определения всех разделенных веществ (до 2-10%) непосредственно на пластинке за короткий промежуток времени.

Неудивительно, что при развитии тонкослойной хроматографии, применение десинтометров увеличивается, чувствительность и, следовательно, точность определения концентрации разделенных веществ повышается и приближается к точности высокоэффективной жидкостной хроматографии. [Алесковский В.Б., Бардин В.В., Булатов М.И. Физико-химические методы анализа. Практическое руководство.- Л.: Химия, 1988. - 376с.]

1.4.17 Способы проведения тсх

Подготовка пробы является очень ответственной операцией в ТСХ. Размывание в ТСХ в первую очередь связано с качеством нанесения стартовой зоны образца.

Выбор растворителя и способы нанесения пробы

К растворителю, из которого пробу наносят на слой сорбента, предъявляют следующие требования: полная растворимость в нем всех компонентов пробы; относительная летучесть (для быстрого удаления с пластины перед началом разделения); низкое значение Rf (при использовании полярных растворителей, в которых Rf разделяемых веществ близко к 1, пробы хроматографируются непосредственно при нанесении, что искажает форму стартового пятна и может влиять на Rf, особенно при ТСХ в менее полярных элюентах); хорошая смачиваемость слоя (важно для ОФТСХ).

Стартовая зона должна быть по возможности минимальной, в особенности для ВЭТСХ. Слишком высокая концентрация вещества в стартовом пятне может замедлить растворение пробы при элюировании.

Для нанесения проб используют стеклянные платино-иридиевые капилляры, микропипетки, шприцы, а также специальные дозирующие устройства, например, платино-иридиевые капилляры с максимальным объемом дозирования 22 нл на 1 м длины. При отборе одной и той же пробы капилляром воспроизводимость введения пробы составляет ±0,7% от ее объема.

При нанесении вязких проб можно нагревать пластины или подсушивать их феном для непрерывного испарения растворителя. Использование двухфазных пластин с предадсорбционным слоем снимает многие проблемы. На границе двух сорбентов зона сжимается в виде узкой полосы независимо от качества нанесения стартового пятна (рис. 2).

Рис. 2. ТСХ смеси красителей на двухфазных пластинах с предадсорбционным слоем.

Рис. 3. Последовательность операций при нанесении образца контактным способом

Пробу можно сконцентрировать в узкую стартовую зону при погружении пластины в растворитель, для которого значения Rf всех компонентов близки к 1, и пропусканием его несколько выше зоны нанесения пробы, после чего элюирование прекращают, а пластину быстро высушивают. Подобную операцию повторяют несколько раз. Для вязких и разбавленных проб эффективен способ контактного нанесения. На рис. 3 показана последовательность операций нанесения пробы по этому методу:

а) над отверстием в металлической пластине помещают смоченную перфторкосином этиленпропиленовую пленку, которая не смачивается никакими растворителями;

б) с помощью вакуумирования пленка плотно прижимается к пластине и слегка втягивается в отверстие, образуя углубление;

в) в углубление вносят пробу, которая остается там в виде шарообразной капли, так как не смачивает пленку;

г) растворитель испаряют, подсушивая сверху феном, пока шарик не уменьшится до нужного размера;

д) пластину помещают слоем вниз на пленку над пробой и, заменяя вакуум легким давлением, переносят на нее пробу.

Этот метод позволяет нанести на пластину одновременно несколько образцов без их предварительного растворения и концентрировать разбавленные пробы.

Существенным является постоянство расстояния линии нанесения проб от нижнего края пластины и линии погружения пластины в элюент.

Способы проведения тсх

Линейная, круговая и антикруговая ТСХ. В колоночной жидкостной хроматографии возможно только линейное движение элюента. В ТСХ благодаря открытому слою сорбента можно осуществить три типа элюирования: линейное, круговое и антикруговое (рис. 4). Кроме того, в ТСХ можно реализовать дополнительно различные методики, позволяющие значительно увеличивать пиковую емкость.

Наиболее широко используют линейное развитие хроматограмм. Пробы наносят на стартовую линию параллельно одной из сторон пластины. Пластину помещают вертикально в хромато-графическую камеру, на дно которой налит элюент, и проводят восходящую ТСХ. В линейной ТСХ с увеличением Rf, вещества размывание увеличивается. Линейное развитие хроматограмм можно осуществить и при горизонтальном положении пластины

Рис. 4. Типы элюирования в ТСХ: а – линейное; б – линейное (горизонтальное); в – круговое; г – антикруговое с подачей на нее элюента с одной или с обеих сторон.

Для восходящей линейной ТСХ в качестве хроматографической камеры можно использовать любой сосуд прямоугольной или цилиндрической формы. Однако в таких камерах трудно получить воспроизводимые результаты, так как по мере поднятия элюента по пластине происходят фронтальное разделение элюента в слое сорбента (полизональная ТСХ), адсорбция и капиллярная конденсация компонентов элюента из паровой фазы на сухую часть пластины и другие процессы. В подобных камерах, можно проводить ТСХ с насыщением (стенки камеры покрывают фильтровальной бумагой, смоченной элюентом) или без насыщения.

Для уменьшения влияния паровой фазы в линейной ТСХ используют «сэндвич»-пластины. С трех сторон двух пластин снимают узкий слой сорбента и, проложив между ними прокладку (толщина 0,5—2 мм), плотно скрепляют такой «сэндвич»-зажимом и опускают в камеру с элюентом. ТСХ проводят, таким образом, одновременно на двух пластинах, расположенных слоем друг к другу. В качестве второй пластины можно использовать, стеклянную подложку без слоя адсорбента.