В сравнительных опытах по многократному отмыванию эмбрионов использовали буферные среды, приготовленные за 10–15 мин. до начала поиска эмбрионов. Отмывная среда для эмбрионов состояла из стерильного буфера Дюльбекко с добавлением 15–20% инактивированной фетальной сыворотки, которую в стерильных условиях расфасовывали в полиэтиленовые ампулы по 2 мл. В другой емкости готовили такую же среду с добавлением комплекса антибиотиков гентамицин-ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл). При отмывании использовали микрошприц и микропипетку для захвата эмбрионов с минимальным объемом среды. Устройство применяли с целью захвата, переноса и микробной деконтаминации эмбрионов.

Культивирование эмбрионов проводили при температуре 37,5°С без доступа кислорода в модифицированной среде Дюльбекко, содержащей 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота.

В среду для культивирования подопытных эмбрионов вносили комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл), в первом контроле использовали пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (50 Ед/мл), во втором контроле для культивирования эмбрионов использовали среду без антибиотиков.

Эмбрионы в средах с антибиотиками выдерживали 2 часа. Затем меняли среду и культивировали 72 часа. Морфологическое состояние эмбрионов оценивали через 2, 24, 48 и 72 часа.

4.2.4 Влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионов

При проведении опытов по определению влияния микробного фактора на приживляемость эмбрионов использовали чистые культуры микроорганизмов, ранее выделенные из половых путей коров-доноров и телок-реципиентов. Инокуляцию отмытых и подготовленных к пересадке эмбрионов проводили чистыми суточными культурами. Чистые культуры Stapha и Ecoli выделяли методом Коха. Принцип метода заключается в получении чистой культуры из колонии, рост которой считали результатом развития одной клетки.

Для выделения чистой культуры производили высев на поверхность агаровой среды из накопительной культуры (с ее разведения). Разведение делали с таким расчетом, чтобы получить на поверхности агаровой среды изолированные колонии. Для посева на поверхность плотной агаровой среды наносили каплю этой культуры, которую осторожно распределяли по всей поверхности стерильным шпателем с последующим переносом ее на поверхность агара последовательно во вторую, третью и четвертую чашки. В первых двух чашках после инкубации при температуре 37°С для Staph. aureus и 43 «С для E.coli наблюдали «сплошной» рост микроорганизмов, тогда как в последующих чашках отмечали рост изолированных колоний. Одну из колоний отбирали стерильной петлей и производили высевы в пробирки с МПБ и на поверхность скошенного агара. Идентификацию E.coli проводили путем высева на среду Булира и Эндо, a Staph. aureus на МПБ и МПА с добавлением 1% глюкозы.

Чистые культуры Staphaureus и Е. coli в разведении 1:10 контаминировали в среды с эмбрионами.

Для получения определенного количества микроорганизмов в 1 мл среды необходимо было получить суспензию этих культур и приготовить их разведение. Чаще всего для инокуляции используют чистые суточные культуры микроорганизмов в разведении 1:10 – 1:10. Для приготовления таких разведении, стерильный физиологический раствор разливали по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исходной суспензии, взятой стерильной пипеткой, переносили в первую пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора – получали первое разведение 1:10. Затем этой же пипеткой брали 1 мл полученного разведения и переносили его во вторую пробирку. Получали второе разведение

Таким же образом готовили и последующие разведения.

В эксперименте по определению влияния микробного факторана приживляемость эмбрионов было взято две группы животных-аналогов по 20 голов в каждой. Телкам-реципиентам опытных групп пересаживали эмбрионы, инокулированные чистыми культурами микроорганизмов в вышеуказанных разведениях. 10 животным трансплантировали эмбрионы, инфицированные Staph. aureus, другим 10 – эмбрионы с внесенной культурой E.coli, 20 контрольным телкам пересаживали эмбрионы, отмытые в пяти чашках стерильными буферными средами, без добавления микроорганизмов.

В природе отмечено, что микроорганизмы в ассоциациях могут быть синергистами либо антагонистами. Поэтому нами проведены исследования по определению антагонизма микроорганизмов, выделенных из половых путей самок. В этих опытах применяли метод посева испытуемых микробов на чашках Петри с МПА радиальными штрихами к предварительно выращенным колониям предполагаемого антагониста по методике В.В. Аврех и А.Ф. Зак, описанной в справочнике И.О. Биргера (1973).

В экспериментах по определению бактериальной загрязненности половых путей доноров и реципиентов нами выделено в основном 4 вида бактерий: Bac.subtilis, E.coli, Staph.aureus и Ps.aeruginosa. Перечисленные виды микроорганизмов относятся к группе возбудителей специфических половых инфекций. Известно, что в определенных условиях резистентность организма значительно ослабевает и нормальный количественный и качественный состав микрофлоры изменяется или активизируется деятельность имеющихся микроорганизмов.

Попадание микробов в глубокие отделы полового аппарата самки в природных условиях при естественном спаривании явление не столь уж редкое. Именно вследствие этого возникла у самок активная защитная реакция в эстральном периоде. И у самих зародышей в процессе эволюции выработался защитный механизм, особенно необходимый на ранних стадиях развития, когда еще не существует плацента с ее барьерной функцией. Это подтверждено опытами Б.П. Токина(1956).

4.3 Анализ экономической деятельности предприятия

Таблица 4.3.1. Анализ фонда заработной платы Харьковского биотехнологического центра