Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр (ФЭК - 56 М). В пробирку к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют стоять на 10 мин. Измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор). Измеряют при тех же условиях стандартный раствор.

Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемоглобинцианида, или по формуле:

Hb (г %) = Еопт · С · К · 0,001, где

Ест

Еопт - зкстинкция опытной пробы;

Ест - экстинкция стандартного раствора;

С - концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг %;

К - коэффициент разведения крови;

0,001 - коэффициент для подсчета мг / 100 мл в г / 100 мл.

2.3. Определение общего объема эритроцитов (гематокрита)

Определение гематокрита с помощью микроцентрифуги (1979). Принцип. Центрифугирование крови определенное время при постоянном числе оборотов центрифуги с последующим определением результата по специальной шкале.

Реактивы. Антикоагулянты: гепарин - 5000 ЕД/мл разводят дистиллированной водой в соотношении 1 : 5 или этилендиаминтетрауксусной кислоты динатревая соль (ЭДТА Na2, трилон Б), 40 г / л.

Оборудование:

1. Микроцентрифуга МЦГ - 8;

2. Капиллярные трубки (в комплекте с центрифугой). Можно использовать капиляры для определения С - реактивного белка.

Ход определения. Предварительно обработанный антикоагулянтом и высушенный капилляр заполняют кровью из пальца на 7/ 8 длины. Укупоривают капилляр с одного конца специальной пастой. Помещают в ротор центрифуги так, чтобы укупоренные концы упирались в резиновую прокладку, и центрифугируют 5 мин при 8000 об /мин. По отсчетной шкале, приложенной к центрифуге МЦГ - 8, определяют гематокритную величину.

2.4. Определение количества эритроцитов

Унифицированный метод подсчета в счетной камере (1972). Принцип. Подсчет эритроцитов под микроскопом в определенном количистве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мл крови, исходя из объема квадратов и разведения крови.

Реактивы. 0,9 % раствор хлорида натрия или раствор Гайема. Специальное оборудование:

1. Счетная камера Горяева;

2. Микроскоп.

Разводят исследуемую кровь в 200 раз. Для этого в сухую пробирку отмеривают 4 мл реактива 1 или 2. Пипеткой набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей и кровь выдувают на дно пробирки, пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости, повторно набирая ее и выдувая в пробирку, содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента счета.

Подготавливают счетную камеру: протирают насухо камеру с сеткой и покровное стекло, затем покровное стекло притирают к камере, слегка надавливая на стекло таким образом, чтобы по краям его появились радужные полосы (это свидетельствует о требуемой высоте камеры - 0,1 мм).

Заполняют счетную камеру разведенной кровью: предварительно несколько раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха заполнила всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Заполненую камеру оставляют в горизонтальном положении 1 мин (для оседания эритроцитов).

Для подсчета эритроцитов, не меняя горизонтального положения камеры, помещают ее на столик микроскопа (объектив 8 х, окуляр 10 х) находят верхний левый край сетки. Счет производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах.

Рекомендуется считать клетки в квадратах сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, не попали дважды в счет, принято для каждого квадрата считать расположенные на определенных двух линиях.

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата ( 1 мкл), по следующей формуле:

4000

Х = а · 4000 · 200 , где

80

Х - число эритроцитов в 1 мкл крови;

а - число сосчитанных эритроцитов.

В результате сокращения Х = а · 10000 (Меньшиков, 1987).

2.5. Определение общего билирубина

Метод Ендрасика - Грофа (1972).Принцип. Под воздействием HCI разрывается тетрапироловая связь билирубина и образуются два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розового-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

Реактивы: 1. Кофеиновый реактив 1,75 мл;

2. Диазосмесь 0,25 мл;

3. Сыворотка 0,5 мл.

В две пробирки (одна опытная и одна холостая) вводят сыворотку и реактивы. Для холостой пробы требуется: 0,5 мл сыворотки, 1,75 мл кофеинового реактива и 0,25 мл раствора хлорида натрия. Для определения общего билирубина пробу оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии краска не изменяется. Измерение проводят при длине волны 500-560 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателя общего билирубина вычитают показатель холостой пробы. Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Калибровочный график строится по готовому набору реактивов “Билирубин-эталон” (“Лахема”). Набор Био-Ла-Тест “Билирубин-эталон” включает:

1.Билирубин лиофилизированный;

2. Альбумин лиофилизированный;

3. Калибровочная линейка до 170 мкмоль/л.

2.6. Определение прямого билирубина

Реактивы: 1. Сыворотка 0,5 мл;

2. Раствор хлорида натрия 1,75 мл;

3. Диазосмесь 0,25 мл.

В две пробирки (одна опытная и одна холостая) вводят реактивы. Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5-10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин.

Измерение проводят при длине волны 500 - 560 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы. Расчет производят по калибровочному графику.

2.7. Определение непрямого билирубина

В сыворотке крови на долю непрямого билирубина приходится 75%. Исходя из этого, находим НБ по формуле:

НБ = ОБ - ПБ.

2.8. Методы статистической обработки результатов

Полученные данные были обработаны статистически (Лакин, 1980). Применялся параметрический метод вариационной статистики.

1. Нахождение среднего арифметического значения членов совокупности (М) и среднего квадратичного оклонения (m) велось по формуле:

М = å ; s = ± Ö S • a2

n n - 1 ,

где S - сумма вариант;

n - число вариант;

s - среднее квадратичное отклонение.

2. Определение m - средней квадратичной ошибки:

m = ± s