После застывания агара, чашки Петри переворачивали и помещали в термостат в температурой 37° С на 48 часов. Через 48 часов подсчитывали общее число колоний бактерий, выросших на чашках. Колонии, выросшие на поверхности, а также в глубине агара, подсчитывали с помощью лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Для этого чашку клали вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечали со стороны дна тушью или чернилами для стекла.

Для определения общего количества микробов в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножали на степень разведения анализируемого продукта. За окончательный результат определения количества бактерий в 1 г анализируемого продукта принимали среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.

Определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта. Сущность метода заключается в способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в средах «ХБ», Хейфеца и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а в среде «Кесслер» в поплавке образуется газ вследствие расщепления глюкозы.

Цель определения этой группы бактерий – проверка соблюдения режима при варке колбас.

При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической идентификации.

В пробирки, содержащие по 5 куб. см среды «ХБ», среды Хейфеца двойной концентрации или среды КОДА, вносили по 5 куб. см испытуемой взвеси стерильной пипеткой вместимостью 5-10 куб. см с широким концом.

Допускается применение среды Кесслер по 10 куб. см.

Пробирки со средами «ХБ», Кесслер, Хейфеца и КОДА поместили в термостат с температурой 37° С на 18–20 часов.

При росте бактерий группы кишечной палочки среды «ХБ» и КОДА окрашивалась в желтый цвет, среда Хейфеца приобретала также желтый цвет, который может меняться до салатно-зеленого, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.

Для окончательного заключения о присутствии в продукте бактерий группы кишечной палочки проводили высев со среды Кесслер (забродившие пробирки) или Хейфеца (изменившие цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо или Плоскирева, или Левина. Чашки Петри помещали в термостат с температурой 37° С. Через 18-20 часов посевы просматривали. На среде Эндо бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или розово-красные без блеска, на среде Плоскирева – кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина – темно-фиолетовые колонии или фиолетово-черные блестящие. Из подозреваемых колоний готовили мазки, которые окрашивали по Граму.

Специфическое изменение среды «ХБ» и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.

При заведомо высокой обсемененности анализируемый продукт массой не более 0,25 г помещали в пустую пробирку, в которую закладывали комочек стерильной фильтрованной бумаги размером 5 ´ 5 см, и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой подталкивали материал до дна (не уплотняя), в пробирку наливали среду «ХБ», КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации), заполняя ее на 3\4 высоты пробирки. Пробирки помещали в термостат с температурой 37° С. на 8-10 часов. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде Хейфеца среда изменяет свой цвет из красно-фиолетового в желтый, который затем может меняться до салатно-зеленого.

Обнаружение грамотрицательных палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.

Определение бактерий из рода сальмонелл в 25 г продукта. Сущность метода заключается в определении характерного роста сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических.

Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы вносили во флакон Сокслета, содержащий 100 куб. см среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористомагниевой среды М). Жидкость во флаконе должна подняться до метки 125 куб. см. Флаконы тщательно встряхивали и помещали в термостат с температурой 37° С. Через 16-24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли (диаметр 0,4 – 0,5 мм) или пастеровской пипетки проводили посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар (по выбору).

Чашки с посевами помещали в термостат с температурой 37° С; посевы просматривали через 16-18 часов.

На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии.

На среде БФА сальмонеллы образуют крупные, гладкие, красноватого оттенка прозрачные колонии (колонии сальмонеллы тифи суис, как и на среде Эндо – мелкие). Бактерии группы кишечной палочки образуют колонии желто-зеленоватого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 часа.

На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но колонии более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо.

На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.

На висмут сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При том наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют некоторые серологические типы из группы С, которые на этой среде растут в виде нежных светло-зеленых или серовато-зеленых колоний.

Изолированные колонии, характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевали на трехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Посевы помещали на 12-16 часов в термостат с температурой 37° С.

При росте бактерий из рода сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука – розовый, столбик – желто-бурый; газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, сероводородообразующие – вызывают потемнение столбика.

Другие грамнегативные бактерии дают следующие изменения цвета среды:

· Бактерии группы кишечной палочки – вся среда окрашивается в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;

· Бактерии из группы протея – среда окрашивается в ярко-красный цвет, может образоваться черный осадок;

· Шигеллы и возбудители брюшного тифа – косяк окрашивается в розовый цвет, столбик – в синий, или сине-зеленый.

Допускается вместо среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука посев на углеводные среды в короткий пестрый ряд, включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, и мальтозой, полужидкий агар уколом (для определения подвижности) и бульон Хоттингера для определения образования индола и сероводорода.

Для дальнейшей идентификации бактерий готовили мазки, которые окрашивали по Граму, микроскопировали и изучали серологические свойства микроорганизмов путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с поливалентной сывороткой проводили идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток.