x1 - концентрация биомассы в начальный момент времени, мг/л;

(t2-t1) – промежуток времени, в течение которого возросла биомасса, ч.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Известно, что бактериальный штамм LPM-4 характеризуется уникальной потребностью в ЭДТА для роста клеток и не растет на средах в отсутствие ЭДТА. Совместную ассимиляцию ЭДТА и глюкозы штаммом LPM-4 можно рассматривать как процесс кометаболизма, при котором ЭДТА является ростовым субстратом, а глюкоза - косубстратом, ее метаболизм зависит от присутствия ЭДТА.

Опыт проводили в два этапа:

1) Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4;

2) Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата.

3.1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4

Бактерии выращивали на ЭДТА-содержащей среде с добавлением глюкозы в различные периоды культивирования: до посева или на 1, 2, 3, 4, 5, и 6 сутки роста клеток (рис. 6).

3.1.1 Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА бактериальным штаммом LPM-4

Данные об изменении плотности биомассы, рН, концентрации ЭДТА и аммония в различных вариантах сред представлены в таблицах 1-8.

Во всех вариантах опыта деградация ЭДТА отмечалась уже на 1 сутки роста и заканчивалась на 3 сутки, независимо от присутствия глюкозы в среде. Таким образом, можно сделать заключение, что присутствие косубстрата (глюкозы) не оказывало влияния на деградацию ростового субстрата (ЭДТА).

При внесении глюкозы в среду до посева бактерий (вариант 2) потребление глюкозы началось только на 3 сутки роста, после полной деградации ЭДТА, и закончилось на 8 сутки роста (приложение 2, рис. 3.1.1.1). Можно предположить, что энергия, образующаяся в процессе деградации ЭДТА, используется клетками для индукции ферментов метаболизма глюкозы или для ее транспорта. Потребление глюкозы сопровождалось увеличением плотности биомассы в два раза по сравнению с контролем.

При внесении глюкозы в среду на 1 сутки роста бактерий (вариант 3) динамика ее ассимиляции была такой же, как в варианте 2. Потребление глюкозы началось после исчерпания ЭДТА из среды (3 сутки), закончилось на 8 сутки культивирования и привело к двукратному увеличению плотности биомассы (приложение 3, рис. 3.1.1.2).

Иная картина ассимиляции глюкозы наблюдалась при ее внесении в среду на 2 сутки роста бактерий, когда остаточная концентрация ЭДТА снизилась в 1,7 раза (вариант 4). Потребление глюкозы началось только на 4 сутки, затем наблюдалась длительная лаг фаза, когда концентрация глюкозы в среде не изменялась; интенсивная ассимиляция глюкозы происходила с 6 до 10 суток культивирования (приложение 4, рис. 3.1.1.3).

При внесении глюкозы в среду на 3 сутки роста клеток, когда деградация ЭДТА закончилась (вариант 5), глюкоза не потреблялась в течение 6 суток и только с 9 суток началась ее интенсивная ассимиляция (приложение 5, рис. 3.1.1.4). Таким образом, при внесении косубстрата в период, когда закончен метаболизм ростового субстрата, индукция ассимиляции косубстрата требует длительной лаг фазы, вероятно, из-за недостатка энергии.

При внесении глюкозы в среду на 4-6 сутки культивирования (варианты 6, 7 и 8), т.е. через 1, 2 и 3 суток после полного потребления ЭДТА, не обнаружено ее ассимиляции (приложение 6-8, рис. 3.1.1.5-3.1.1.7).

3.1.2. Динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4

На рис. 3.1.2.1. представлена динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4 при культивировании на среде с ЭДТА. Как видно из рисунка, максимальная удельная скорость достигается на 2 сутки и составляет 0,042 ч-1.

В случае, когда добавляли глюкозу в среду до посева (рис. 3.1.2.2), максимальная удельная скорость была выше, чем в контроле, и составляла 0,057 ч-1 (2 сутки). При добавлении глюкозы в среду на 1 и 3 сутки роста бактерий (рис. 3.1.2.3.- 3.1.2.5.) наблюдалось два (а при добавлении глюкозы на 2 сутки – три) пика удельных скоростей. Первый пик характеризует рост за счет потребления ЭДТА. В варианте 3 (рис. 3.1.2.3.) он составляет 0,055ч-1 (2 сутки), в варианте 4 (рис. 3.1.2.4.) –0,049 ч-1, а в варианте 5 (рис. 3.1.2.5.) – 0,042 ч –1. Второй пик удельной скорости роста – за счет потребления глюкозы - был значительно ниже, чем за счет потребления ЭДТА. Максимальная удельная скорость роста за счет потребления глюкозы в третьем варианте составила 0,007 ч-1, в четвертом –0,006ч-1 и 0,016 ч-1, а в пятом –0,022 ч-1. Таким образом, добавление в среду глюкозы на 1-3 сутки приводит к повторному увеличению скорости роста бактерий, но в значительно меньшей степени, чем при начальной ассимиляции ЭДТА.

Наибольшее значение удельной скорости роста характерно для варианта, когда глюкоза добавлялась в среду до посева бактерий. Следовательно, время добавления косубстрата в среду значительно влияет на скорость роста бактерий.

3.1.3. Накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4

Анализируя рис. 3.1.3., можно сделать вывод, что концентрация аммония в среде увеличивается по мере деградации ЭДТА, поскольку ионы аммония – продукты деградации ЭДТА. Во всех вариантах концентрация аммония достигает максимального значения и остается на постоянном уровне в течение нескольких дней. Снижение концентрации аммония при длительном культивировании бактерий объясняется, по-видимому, тем, что клетки потребляют его .

При добавлении глюкозы снижение концентрации ионов аммония начинается раньше, чем в контроле. Интересен тот факт, что накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4 на средах с добавлением глюкозы до посева и на 1 сутки роста бактерий происходит сходным образом, причем концентрация аммония в опытах значительно меньше таковой в контроле. Концентрация аммония в опыте на среде с добавлением глюкозы на 2 и 3 сутки роста также ниже контроля. Вероятно, это связано с тем, что аммоний используется для роста клеток в присутствии глюкозы.

3.1.4. Показатели роста штамма LPM-4 при кометаболизме ЭДТА и глюкозы

В таблице 3.1.4. представлены сравнительные результаты показателей роста штамма LPM-4 на различных вариантах сред. На средах с глюкозой суммарная биомасса включает биомассу, образованную как за счет потребления ЭДТА, так и за счет потребления глюкозы. Поскольку концентрация ЭДТА во всех вариантах сред была одинаковой (0,873 г/л), можно предположить, что количество биомассы, образованной из ЭДТА на средах с глюкозой, было таким же, как в контроле (0,196 г/л). Следовательно, если вычесть из суммарной биомассы количество биомассы, образованной из ЭДТА, мы получим количество биомассы, образованной из глюкозы.

Из таблицы видно, что наибольший выход клеток по массе из глюкозы достигается на среде с добавлением глюкозы на 3 сутки роста бактерий. Поскольку ЭДТА и глюкоза характеризуются различным энергосодержанием, правильнее сравнивать выход из этих субстратов не по массе, а по энергии. С этой целью рассчитывали энергетический выход клеток. Наибольший выход биомассы по энергии из глюкозы характерен для опыта на среде с добавлением глюкозы на 3 сутки роста бактерий.