Еще один пример, при разложении древесины легко гидролизуемая целлюлоза (косубстрат) служит источником энергии и электронов для образования Н2О2, с участием которого расщепляется устойчивый к деградации лигнин.

Такие микроорганизмы, как Bacillus cereus SNK 12, Paenibacillus polymyxa SNK 2, Azotobacter chroococcum ANK ΙΙ, Ochrobactrum intermedium ANK Ι cпособны к деградации азобензола в условиях кометаболизма. При этом В.cereus SNK 12 в качестве более доступного источника углерода использует глюкозу, а О. intermedium – хризоидин и метиловый оранжевый [19].

Другой пример: кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens. Исследована зависимость интенсивности трансформации флуорена бактериями Rhodococcus rhodochrous 172 при росте на сахарозе и Pseudomonas fluorescens 26K при росте на глицерине от концентрации ростового субстрата и фазы роста культур [20].

Исследования численности и функционирования различных групп бактериобентоса водохранилища вблизи г. Череповца выявили явление кометаболизма. При наличии легкоусвояемых соединений органических веществ, бактериальные сообщества подвергают соокислению трудноминерализуемые соединения сточных вод, таких как полихлорированные бифенилы, полиароматические углеводороды, нефтепродукты, металлы, фенолы, соединения азота, серы и др. вещества [21].

При исследовании кометеболизма винилхлорида и этена у Pseudomonas aeruginosa strain DL1 было обнаружено, что при длительном культивировании (более 40 суток) неростовой субстрат винилхлорид становится ростовым [22].

1.4. Периодическое культивирование

При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигает минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве) [24]. Кривая роста бактериальной культуры показана на рис. 1.5. Кривой роста называется кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени. Кривая роста позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности.

Лаг-фаза (начальная фаза). Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то адаптация к новым условиям может быть связана с синтезом новых ферментов, которые ранее были не нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом. Хорошим примером влияния субстрата на синтез ферментов служит диауксия.

Экспоненциальная фаза характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость зависит от вида бактерий и от среды. Величина клеток у многих бактерий остается постоянной. Но нередко клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, температура), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата – при снижении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, скорость роста начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может уменьшаться также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления или накопления токсичных продуктов обмена. Все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе.

Фаза отмирания и причина гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Число живых клеток может уменьшаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз) (рис. 5) [24].

1.5. Периодическое культивирование с подпиткой (fedbatchculture)

Термин «периодическая культура с добавлением источников питания» ввели Иошида и др. для обозначения периодической культуры, в которую непрерывно добавляется питательная cреда [25].

Простое периодическое культивирование характеризуется ростом клеток без подачи дополнительных порций субстрата после посева культуры. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса. Для предотвращения негативных последствий лимита субстрата применяется техника культивирования с подпиткой, при этом субстрат или другие необходимые компоненты добавляются либо непрерывно, либо по сигналу от какого-либо датчика [26].

Периодическая культура с добавлением источников питания развивалась эмпирически для некоторых производственных ферментационных процессов, таких, как получение пенициллина, пекарских дрожжей и удаление отходов путем ферментации.

Для оптимизации выхода продуктов, выделяемых в среду, важно усилить биосинтетическую способность клеток бактерий, а метод культивирования с подпиткой позволяет продлить вторую фазу роста и повысить выход внеклеточных метаболитов. Ограничение скорости поглощения субстрата скоростью его доставки оказывается способом преодоления «катаболитной репрессии» образования продукта. При производстве пекарских дрожжей потребление кислорода регулируется скоростью добавления сахара.

Метод периодических культур с подпиткой использовали при культивировании рекомбинантного штамма Escherichia coli для получения аналога человеческого коллагена. Культура с подпиткой оказалась наиболее эффективным путём для достижения высокой плотности клеток и высокой продуктивности [27].

В периодическом режиме с подпиткой концентрированным субстратом исследовалась деструкция фенола при совершенствовании процесса обезвреживания токсичных стоков ксенобиотиков с использованием гибридной системы очистки с совмещением процесса химического и биологического окисления по месту и времени [28].

Периодическая культура с добавлением источников питания, кроме того, моделирует некоторые природные микробные системы, как, например, инфекцию мочевых путей. Теория такой культуры показывает, что она должна иметь важное и уникальное применение в управлении ферментационными процессами [25].

Глава 2. Материалы и методы