4. Са2 + -АТРаза привлекла внимание ученых в связи с тем, что, как предполагается, ее ферментативная активность определяется так называемым «липидным кольцом», или «пограничным липидным слоем», непосредственно примыкающим к белку. Активность Са2 + -АТРазы не зависела от содержания холестерола в реконструированных везикулах, а чистый холестерол тоже не оказывал никакого влияния на ее активность. Это наводило на мысль, что холестерол в указанном пограничном слое отсутствует. Однако работы по связыванию свидетельствовали об обратном, а дело было в том, что относительная константа связывания холестерола с белком примерно вдвое меньше, чем для фосфатидилхолина. Небольшое количество холестерола присутствует и в природных мембранах, содержащих данный фермент. Относительное сродство Са2 + -АТРазы к фосфо-липидам почти не зависит от природы полярной головки, а также типа ацильных цепей, хотя при реконструкции фермента с разными липидами ферментативная активность существенно варьирует.

Скорость обмена пограничных липидов со свободными липидами

Термин «пограничный липидный слой» был введен в связи с появлением идеи о существовании стационарного слоя липида, связанного с поверхностью белка, например цитохромокси-дазы. Под «стационарностью» понимается отсутствие обмена липидов за время, сравнимое со временем оборота фермента, т. е. ~ 10 ~3 с, поэтому такой фермент вместе с его непосредственным окружением может рассматриваться как долгоживущий комплекс. Во всех изученных к настоящему времени случаях это условие не выполняется, но термин «пограничный липидный слой» остается полезным описательным термином, если речь идет о ближайшем липидном окружении белка.

Данные 2Н-ЯМР четко показали, что пограничные липиды быстро обмениваются с основной массой липидов в бислое. Спектры ЭПР меченых фосфолипидов свидетельствуют о существовании свободных и связанных липидных компонентов, в то же время аналогичные эксперименты с дейтерированными липидными зондами говорят о том, что организация и динамические свойства липидов в присутствии таких белков, как цитохромоксидаза, практически не изменяются. Такое расхождение, по-видимому, объясняется различиями в характерных временах измерения двух методов. Время обмена пограничных липидов составляет 10"6— 10 7 с, поэтому метод 2Н-ЯМР выявляет только один тип липидов, тогда как данные ЭПР свидетельствуют о наличии двух разных липидных популяций.

Если коэффициент латеральной диффузии фосфолипидов в мембранном бислое равен величине, приведенной в табл. 5.2, то среднее время перескока липидной молекулы из одного положения в мембране в соседнее составляет около 10"7 с. Наличие такого быстрого обмена между пограничными и свободными липидами позволяет предположить, что в известных нам случаях липиды, находящиеся по соседству с белком, и свободные липиды практически равноценны. Необходимо подчеркнуть, что это только грубые оценки, полученные для относительно небольшого числа белков, главным образом производных фосфатидилхолина.

5.2 Изменения в липидном бислое, связанные с присутствием интегральных мембранных белков

Результаты большинства исследований липидных бислоев методом 2Н-ЯМР с применением дейтерированных фосфолипидов свидетельствуют о том, что белки оказывают лишь слабое влияние на упорядоченность липидов в бислое и их динамические свойства. Сходные данные были получены методами 'Н-, l9F- и 3|Р-ЯМР. Имеются сообщения о существовании пограничных липидов в природных мембранах. Эти данные получены методом 3,Р-ЯМР и предполагают иммобилизацию полярных головок дол-гоживущими липидно-белковыми комплексами. Однако эти факты нельзя считать окончательно установленными. Так, из данных ЯМР можно сделать следующие общие выводы: 1) скорость обмена между пограничными и свободными липидами весьма велика; 2) в присутствии белков упорядоченность связанных липидов почти не изменяется; 3) скорость переориентации ацильных цепей в присутствии белков слабо уменьшается в частотном диапазоне 109с~'; 4) соседство с трансмембранными белками не сказывается существенным образом на ориентации и динамических свойствах полярных головок. По данным ЯМР, организация и динамика липидов при контактировании с белками очень слабо, но изменяются. Это связывают с некой «жесткостью» поверхности белка, контактирующего с липидом, но сами эффекты весьма незначительны.

Влияние мембранных белков на липидные бислои исследовали и многими другими методами. Рассмотрим вкратце некоторые из полученных результатов.

1. Подвижность спин-меченных липидов ограничивается при контактировании их с белками или при захвате липидно-белковыми агрегатами. В большинстве ЯМР-исследований по релаксации сходные эффекты в том же частотном диапазоне не обнаруживаются. Возможно, эти эффекты обусловлены присутствием объемной нитроксидной спиновой метки. Однако, по крайней мере, в одном случае и данные ЯМР, и данные ЭПР свидетельствовали об уменьшении подвижности ацильных цепей в этом временном диапазоне при липидно-белковых взаимодействиях. Единого мнения о том, влияет ли белок на подвижность спиновых меток за пределами пограничного липидного слоя, не выработано. О существовании некоего липидного слоя за пределами пограничного слоя свидетельствовали спектроскопические данные; эти данные объяснялись в предположении, что имеется единый липидный слой, подверженный воздействию белков. В любом случае важно помнить, что методом ЯМР значительные ограничения подвижности обычно не выявляются.

2.Деполяризация флуоресценции мембранных зондов, например ДФГ, зависит от присутствия интегральных мембранных Щелков. По мере встраивания белков в бислой микровязкость последнего возрастет, о чем свидетельствуют поляризационные данные в стационарных условиях. Для согласования экспериментальных данных с представлением о том, что ограничение подвижности испытывают только зонды, соседствующие с белком, использовалось простое моделирование. Однако детальный анализ, Включавший измерения анизотропии образцов во времени, в одном случае показал, что а) влияние белка проявляется в основном в увеличении параметра упорядоченности, т. е. в ограничении диапазона Движения, и б) данный эффект распространяется за пределы пограничного слоя. Однако эффекты, наблюдаемые при работе с этими зондами, не обязательно будут характерны для фосфолипидов.

3.Для определения конфигурации ацильной цепи использовался Метод инфракрасной спектроскопии с фурье-преобразованием. Полученные результаты согласовывались с данными 2Н-ЯМР и свидетельствовали о незначительном изменении упорядоченности ацильной цепи в присутствии белка. Природа наблюдаемых эффектов зависит от свойств ацильной цепи, поэтому построение какой-то общей модели затруднено {34]. Использование дейтерированных препаратов позволяет избирательно изучать различные липиды; так, было выявлено преимущественное взаимодействие между гликофорином и фосфатидилсерином.

4. Для изучения температурного фазового перехода в липидах и влияния мембранных белков на этот переход использовалась дифференциальная сканирующая калориметрия. Вообще говоря, в присутствии интегральных мембранных белков происходят: а) весьма незначительное уменьшение температуры фазового перехода; б) увеличение ширины интервала перехода и в) уменьшение АН перехода. Если в присутствии белка наблюдается только один фазовый переход, то его относят к липидам, которые не подвергаются влиянию белков. Белок как бы изолирует связанные с ними липиды и предотвращает их участие в фазовом переходе. Это приводит к уменьшению молярной энтальпии перехода. Обычно АН0 уменьшается с увеличением содержания белка линейно, что позволяет легко найти число липидных молекул, связанных с одной молекулой белка. Это число варьирует от примерно 20 для бактериородопсина до 685 для белка полосы 3. Сюда входят не только молекулы пограничных липидов, но и липиды, захваченные белковыми агрегатами, находящиеся в обогащенных белком доменах, а также, возможно, липиды, претерпевшие изменения из-за взаимодействий с углеводными цепями гликопротеинов. Латеральное разделение фаз и агрегация белков затрудняют использование этого подхода для получения подробной информации о липидно-белковых взаимодействиях. Однако изучение влияния белков на температурные переходы бинарных смесей липидов позволило выявить преимущественные взаимодействия между гликофорином и фосфатидилсерином и между цитохром с-оксидазой и кардиолипином.