Использование трансгенных мышей при исследовании роли генотипа в процессах обучения и памяти. Методы генной инженерии и молекулярной биологии сделали возможным получение так называемых трансгенных животных. Как говорилось выше, такие исследования — это реализация подхода «от гена к поведению». Как правило, это физиологический и биохимический анализ, а также исследование поведения искусственных мутантов, у которых был видоизменен определенный участок генома. Для их создания в геном животного (в настоящее время используются почти исключительно мыши) вводится новый генетический материал. Таким материалом может быть или участок ДНК, кодирующий измененный ген, уже имеющийся у реципиента, ген от животного другого вида (например, крысы), либо генетическая конструкция, которая выключает какой-либо из генов реципиента (см.: Льюин, 1987; Jones, Mormede, 1999).

Выделенный фрагмент ДНК вводится в геном на ранней стадии эмбрионального развития. С методами введения можно ознакомиться в специа!ьных руководствах. В результате соответствующих манипуляций формируются так называемые химерные животные. Нередко оказывается, что гомозиготные по новой мутации особи (мыши с обоими мутантными аллеями) нежизнеспособны, и ее удается поддерживать только в гетерозиготном состоянии. Однако чаще всего популяция трансгенных мышей представляет собой смесь из животных дикого типа (гомозиготных по нормальному аллелю гена), гетерозиготных особей (имеющих один нормальный и один мутантный аллель) и гомозиготных по мутантному аллелю. Генотип каждого животного можно определить методом полимеразной цепной реакции или иным методом, подвергнув анализу небольшой кусочек ткани животного (обычно для этого отрезают кончик хвоста). Иногда гомозиготные носители нового гена внешне отличаются от нормальных собратьев.

Специальные молекулярно-биологические приемы должны обеспечить достаточно надежную экспрессию новой ДНК в геноме реципиента. В противном случае введенный в геном фрагмент может сохраняться в латентном виде, не обнаруживая себя.

Наиболее часто эксперименты по получению искусственных мутантов или животных-нокаутов проводятся с целью выяснить роль в организме того или иного белка, чаще всего обладающего ферментативной активностью, или белков-рецепторов клеточной поверхности. При работе с нейрогенами, т.е. с генами, которые экспрессируются («работают») в мозге, наибольшее число исследований проведено с выключением белков-рецепторов, избирательно связывающихся с нейромедиа-торами и другими молекулами, влияющими на режим синаптической передачи в нейронах разных структур мозга. В настоящее время насчитывается много сотен мышей-нокаутов с инактивированными генами разных функциональных групп, и их число продолжает расти.

Рассмотрим результаты наиболее известных исследований, в которых оценивали влияние выключения нейрогенов на процессы обучения и памяти.

Экспериментальные схемы обучения, которые используются для тестирования запоминания у лабораторных мышей и крыс, позволяют с большой надежностью проанализировать влияние какого-либо фактора на краткосрочную или долгосрочную память и на процесс собственно усвоения навыка. В качестве «навыка» обычно выбирают выполнение животным простой двигательной реакции или, наоборот, невыполнение (торможение) такой реакции. В целях большей четкости эксперимент строят таким образом, чтобы усвоение навыка происходило при единственном сочетании условного и безусловного раздражителей. Достаточно популярны в таких исследованиях оценка синаптической проводимости гиппокампа электрофизиологическими методами и формирования пространственного навыка в тесте Морриса.

Долговременная посттетаническая потенциация. Важным модельным объектом для изучения процесса обучения стала так называемая долговременная посттетаническая потенциация (long term potentiation, LTP).

LTP — это одно из проявлений синаптической пластичности (т.е. изменения проводимости синапсов), происходящее в результате длительной бомбардировки слоя пирамидных нейронов гиппокампа (область СА1) электрическим раздражением аксонов, оканчивающихся на этих нейронах (т.е. искусственным путем).

Подобные эксперименты в большинстве случаев проводятся на так называемых переживающих срезах гиппокампа, помещенных в специальную питательную среду, т.е. in vitro. В результате потенциации клетки гиппокампа начинают активно реагировать на раздражения, неэффективные до нанесения электрической стимуляции. Для этого процесса (как и для разных форм обучения) необходим целый ряд условий:

активация так называемых NMDA-рецепторов (т.е. белковых молекул, расположенных в мембране нейронов и изменяющих ее проводимость при соединении с N-метил-D-аспартатом, — веществом, имитирующим эффект нейромедиатора);

повышение внутриклеточного уровня ионов кальция (Са2+), что в свою очередь обеспечивается определенным каскадом событий с участием системы так называемых вторичных посредников (циклического аденозинмонофосфата — С-АМР и др.);

участие ряда ключевых ферментов (протеинкиназа-C, Са2+- калмодулинзависимая протеинкиназа II — СаMKII и тирозинкиназа).

Течение LTP в гиппокампе мышей-нокаутов с выключенными генами, кодирующими такие белки, сильно видоизменялось, однако она полностью не исчезала. Одновременно у этих мышей было нарушено формирование пространственного навыка в тесте Морриса.

Гистологическое исследование гиппокампа показало у них нарушения в расположении гранулярных клеток зубчатой фасции, т.е. тех нейронов, аксоны которых образуют iipMF.

Мыши с искусственной мутацией гена CaMKII нормально обучались навыку отыскания безопасного убежища при наличии сигнальных раздражителей, но не могли усвоить этот навык, когда для этого требовалось формирование пространственных представлений, т.е. «пространственной карты» (см. 3.4).

К тому же у них при ритмическом электрическом раздражении гиппокампа с частотой 5-10 в сек (т.е. с частотой тета-ритма, как правило, присутствующего в суммарной электрической активности гиппокампа при исследовательском поведении) LTP не наступала, в то время как при высокочастотном раздражении она развивалась нормально. В норме у мышей могут развиваться обе формы LTP.

Можно проанализировать, как сказывается на процессе обучения противоположное генетическое изменение — «сверхэкспрессия» какого-либо гена. Специальными приемами можно усилить работу гена не во всем мозге, а только в определенных его участках. Такие вполне жизнеспособные животные демонстрируют поразительные видоизменения поведения (Mayford et ah, 1995).

Сверхпродукция белка NMDA-рецептора типа 2В в переднем мозге мутантных мышей сопровождалась резким усилением способности к обучению в ряде тестов (так же как и усилением LTP).

Мутантные мыши превосходили контрольных по усвоению навыка «застывания» (freezing response) при тестировании после однократного применения удара электрического тока, и у них было более прочное запоминание этой условной реакции. Обучение в тесте Морриса у этих мышей также было более эффективным. Данные наблюдения позволяют сделать вывод, важный для нейрофизиологии обучения: