По предложению В. Л. Грубера Лесгафт согласился частным образом, без вознаграждения, работать у него на кафедре в анатомическом институте, выполняя обязанности нештатного прозектора. Материальное положение Лесгафта в это время было незавидным. Не имея постоянного заработка, он подрабатывал репетиторством, преподавал анатомию и химию в Военно-фельдшерской школе при Медико-хирургической академии. Там же, при помощи Грубера, Лесгафту выделили отдельное помещение, где он оборудовал подсобную препаровочную. В ней он пропадал все свое свободное время, кропотливо исследуя сложные анатомические взаимоотношения мышечных слоев промежности. По совету Грубера он решил положить эти исследования в основу своей диссертации.

В конце 1861 года Лесгафт сдал экзамены для получения высшей степени доктора медицины, а в начале 1862 года на следующую степень доктора медицины и хирургии. Стало определяться и его положение. 23 марта 1863 года приказом по военному ведомству о чинах гражданских Петр Францевич Лесгафт был назначен сверхкомплектным ординатором без денежного содержания во Второй военно-сухопутный госпиталь, в женское отделение хирургической клиники профессора А. А. Китера. Такое положение довело возможность Лесгафту довольно свободно распоряжаться своим временем. Он руководит практическими занятиями студентов 2-го курса, читает лекции по анатомии студентам 5-го курса. Он трудится над своей диссертацией.

В это же время Лесгафт увлекся антропологией, изучает варианты строения черепа, особенности роста и формирование его у лиц разного возраста и пола. Выезжая летом заграницу: в Австрию, Германию, Францию, он посещал анатомические музеи и подробно знакомился с коллекцией черепов.

8 мая 1865 года был назначен дискет, где Лесгафт должен был отстаивать свое право на ученую степень. Защита прошла блестяще. К этому времени Лесгафт был уже как полгода женат на Елизавете Андреевне Юргенс. Вместе с ней он отпраздновал свой успех.

1 января 1866 года у молодых родился сын, Борис. В этом же году Петр Францевич наконец был определен на оплачиваемую должность ордината при глазном отделении в том же госпитале. Это давало ему постоянный заработок, который был так нужен. Приобщаясь к офтальмологии, он заинтересовался одним из заболеваний органа зрения - слезоточивостью. Проведя множество таких анатомических исследований, он нашел ответ на вопрос, занимавший врачей- окулистов, и 1 декабря 1866 года выступил на заседании русских врачей в Петербурге с сообщением «О круговой мышце глаза и влияние ее на механизм всасывания слез». Новая работа Лесгафта поразила специалистов глубиной и убедительностью исследования, и Петр Францевич Лесгафт был избран членом Общества русских врачей столицы.

Вскоре за усердную службу Лесгафт был награжден орденом. Св. Станислава 3-й степени.

Весной 1868 года, по ходатайству В. Л. Грубера, Лесгафт уже признанный всеми как один из лучших анатомов, получил, наконец, оплачиваемое место прозектора анатомии, оставаясь одновременно и ординатором в госпитале.

Этот год принес Петру Францевичу Лесгафту еще и степень доктора медицины и хирургии за сочинение «Колотомия в левой поясничной области с анатомической точки зрения». В сентябре он получил сообщение, что он избран по конкурсу на медицинский факультет Казанского университета и утвержден экстраординарным профессором физиологической анатомии. В Казани Лесгафт пробыл 3 года. Он был учредителем Общества естествоиспытателей при Казанском университете, ему принадлежит идея создания антропологического музея, организация экспедиций для его пополнения, открытие лектория по современным проблемам науки. Но через 3 года Лесгафта, по велению царя, уволили из Казанского университета без права преподавания. Поводом послужил конфликт с профессором А.В.Петровым, который самовольно принял экзамены у студентов вместо Лесгафта. Изгнание блестящего профессора взбудоражило весь город. Студенты вывешивали прокламации в защиту Лесгафта, а 7 лучших профессоров университета положили свои заявления об отставке на стол ректора.

24 октября 1871 года, оставив жену и сына в Казани, Лесгафт выехал в Петербург. Там ему пришлось согласиться на единственную работу, которую мог предложить ему Грубер, - частным порядком изготавливать анатомические препараты для ветеринарного отделения. Это дало скудные средства к существованию. Он начинает посещать лекции профессора М.М.Руднева по патологической анатомии и изучает гистологические препараты. Антропология давно занимала Петра Францевич Лесгафта и он пишет большую статью «Задача антропологии и метод ее изучения», которая привлекла новизной и оригинальностью взглядов автора на совсем еще новую отрасль знания. Петр Францевич Лесгафт понимал антропологию как науку о человеке, которая рассматривает не только строение, развитие и отправление различных органов и тканей человека, но и влияние на него окружающей среды. Лесгафт писал: «Познать человека, направить и оценить его действия мы можем только тогда, когда, понимая строение его организма, мы хорошо будем знать влияние на него всех внешних условий, как физических, так и нравственных». Материалистическое понимание неразрывной связи человека с окружающей внешней средой, с воздействием этой среды на анатомическое строение органов и тканей и на их функцию составляло сущность нового прогрессивного учения, получившего вскоре отражение в «функциональной анатомии», создателем и блестящем представителем которой явился Петр Францевич Лесгафт.

Зимой 1871-1872 годов он делал еще первые шаги на этом новом пути, прославившем затем его имя. Неопределенность положения «профессора без кафедры» заставляла его не раз обращаться с прошением в Медицинский департамент для принятия его на службу. 27 апреля 1872 года он был определен сверхштатным младшим чиновником при Медицинском департаменте и летом того же года направлен на борьбу с холерой, вначале в Киевскую, а затем в Могилевскую губернии. Лесгафт успешно справился с порученным ему делом: сумел быстро выявить и изолировать заболевших, убедил жителей деревни соблюдать правила гигиены.

После возвращения Лесгафт вновь занялся анатомическими исследованиями, опубликовал ряд интересных работ по анатомии в медицинских журналах. К этому времени относится начало его работы над теорией и практикой физического образования, над созданием научных основ педагогической и лечебной гимнастики. Изучая анатомические особенности органов движения, он вновь и вновь убеждался в теснейшей связи формы органа с его функцией: развивается и крепнет только тот орган, который активно функционирует. Если орган не тренировать, не давать ему нагрузку, то он неизбежно слабеет и атрофируется.

Анатомо-физиологическая сущность человека определяется его деятельностью. Только постоянная деятельность утверждает и поддерживает в человеке его специфические качества и свойства. Вот почему упражнения, тренировку органов и систем Лесгафт считал необходимой предпосылкой для их нормального функционирования, для здоровой и активной жизни человека.