I.7 Стерилизация питательных сред и аппаратуры

Целью стерилизации является уничтожение всей микрофлоры, которая находится в питательной среде, различных жидких добавках (пеногасители), а также на внутренних поверхностях оборудования, арматуры, подводящих и отводящих коммуникаций.

Необходимость стерилизации вызвана тем, что культуры – продуценты ферментов крайне чувствительны к присутствию других микроорганизмов.

Процесс стерилизации можно расчленить на три основных этапа: нагревание среды или аппарата до температуры стерилизации, выдерживание при этой температуре в течении времени, обеспечивающего гибель всех микроорганизмов и охлаждение стерилизуемого объекта до температур, доступных для засева среды чистой культуры продуцента. Достичь полной стерилизации очень трудно, поскольку для этого надо убить все микроорганизмы, а некоторые из них, особенно спороносные, выдерживают воздействие высоких температур очень длительное время. Свойства стерилизуемых объектов имеют большое значение, так как некоторые вещества усиливают стерилизующий эффект, например, кислоты, а некоторые, наоборот, увеличивают стойкость микроорганизмов к температуре и давлению. Эффективность стерилизации зависит от очень многих факторов: температуры, длительности процесса, состава стерилизуемой среды, конструкции аппарата, степени обсемененности стерилизуемого объекта, требований стерильности на последующих стадиях и т.д.

При поверхностном способе выращивания различных микроорганизмов требуется различная степень термической обработки среды. Если среда в процессе культивирования не перемешивается и не перемещается, то ее абсолютная стерильность необязательна. Обработка среды осуществляется при различных режимах. Стерилизуют аппаратуру для приготовления посевного материала (емкости для засева, кюветы, емкости для воды, для приготовления посевной суспензии, посевные коммуникации), а также производственные кюветы.

При стерилизации жидких питательных сред на выбор оптимального режима стерилизации оказывают влияние гетерогенность жидкой среды, ее физико-химические свойства, качественный и количественный состав. Если среда не содержит твердых частиц и представляет собой гомогенный раствор питательных веществ, то длительность стерилизации при прочих равных условиях может быть меньше, чем для сред, содержащих твердые частицы, так как для их прогревания требуется больше времени. Большее время стерилизации требуется в случае, если в среде есть липиды и она имеет высокое содержание сухого вещества. При наличии в составе среды редуцирующих сахаров, особенно глюкозы и свободных аминокислот, стерилизацию углеводной и аминокислотной фракций следует вести отдельно, чтобы избежать потери сахаров в результате меланоидинообразования. Стерилизация аппаратов и коммуникаций имеет большое значение и при глубинном способе культивирования. Самая тщательная стерилизация может не дать эффекта, если нарушена герметичность оборудования.

При стерилизации оборудования есть опасность даже при высоких температурах не добиться стерильности в результате того, что в процессе тепловой обработки внутренних полостей аппаратов происходит конденсация пара у стенок. Воздух, выделяющийся из парогазовой смеси, покрывает стенки аппарата воздушной пленкой, в результате чего условия нагревания стенки ухудшаются. Плохо поддаются стерилизации различные патрубки и люки, так как в них образуются воздушные пробки. Для улучшения условий стерилизации при конструировании аппаратуры следует сокращать число впаев, увеличивать диаметр и уменьшать высоту отводящих и подводящих штуцеров. Особое внимание уделяется стерилизации аппаратуры и коммуникации для подачи пеногасителя.

На стадии стерилизации ведется постоянный микробиологический контроль стерильности питательной среды, подаваемого в ферментатор воздуха, пеногасителя и т.д. На микробиологическую чистоту проверяют отделение стерилизации, его стены и пол, аппаратуру, коммуникации, а также руки работающих.

I.8 Очистка и стерилизация воздуха

Подавляющее большинство продуцентов ферментов является аэробами, и для их нормального развития в процессе культивирования необходимо подавать в достаточном количестве стерильный воздух. Воздух после аэрации растущей культуры может содержать споры или клетки микроорганизма – продуцента ферментов, потому перед выбросом в окружающую среду он также требует очистки. Особо высокие требования к стерильности предъявляются при подготовке воздуха для аэрации глубинной культуры. Существует несколько способов очистки и стерилизации воздуха, основанных на двух принципах: умерщвление микроорганизмов и их механическое отделение.

Аппаратурное оформление стадии подготовки и очистки воздуха зависит от способа культивирования продуцента. При поверхностном культивировании требования к стерильности воздуха менее жесткие, чем при глубинном, и даже допускается рециркуляция аэрирующего воздуха. Стерильные производственные помещения аэрируются стерильным воздухом, кондиционированным по температуре и влажности. Подготовка воздуха в этих условиях ничем не отличается от подготовки воздуха для аэрирования растущей культуры. Отличие может заключаться лишь в параметрах кондиционирования, но не в снижении требований к стерильности воздуха.

К основным факторам, влияющим на быстрый рост микроорганизмов и максимальный биосинтез ими ферментов, относятся: состав питательных сред, условия приготовления и стерилизация сред, количество и способ подвода воздуха к растущей культуре, правильный выбор условий выращивания продуцента и контроля за этим процессом.

II. ПРИНЦИПЫ ПОДБОРА И МЕТОДЫ ОПТИМИЗАЦИИ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

II.1 Методы определения оптимального состава питательных сред

Основным требованием, предъявляемым к составу питательной среды, является ее полноценность для роста продуцента и обеспечения синтеза целевого продукта. Оптимальный состав среды для каждого продуцента может быть определен двумя способами: методом эмперического подбора и с использованием математических методов планирования экспериментов. Первый способ был до недавнего времени широко распространен во всех отраслях промышленности, использующих микроорганизмы. Знание физиологических особенностей микроорганизмов позволяло биологам методом подбора и изменения какого-либо из факторов на неизменном фоне остальных компонентов подобрать хорошую и продуктивную питательную среду, но такой способ очень длителен. Более прогрессивным в биологических исследованиях является использование математических методов планирования экспериментов, которые позволяют значительно быстрее найти и обосновать оптимальный состав питательной среды.

Большинство математических методов планирования экспериментов имеет целью получение математической модели процесса. Обработка экспериментальных данных ведется в четкой последовательности вычислительных операций и может быть выполнена вручную. Статистический анализ значимости коэффициентов полученного уравнения и его адекватности исследуемому процессу в изучаемом диапазоне изменения параметров процесса позволяет с достаточной уверенностью находить оптимальный состав среды и оптимальные условия культивирования по полученной математической модели процесса.