7. Полимеразная цепная реакция.

До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клонирование являлись единственными способами поиска и выделения специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципиальных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слишком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так как определяются наличием соответствующих рестрикционных сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведения успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество оказывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немедленного использования собранной крови для выделения ДНК или хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследование нетранспортабильных пациентов или родственников, проживающих на отдаленном расстоянии от исследовательских центров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, необходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной активностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны быть использованы в течение очень короткого периода после их приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом требует соблюдения необходимой техники безопасности и наличия специально оборудованного изотопного блока, что возможно лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, необходимость длительной экспозиции автографов значительно удлиняет время получения результатов, что также ограничивает использование методов блот-гибридизации для пренатальной диагностики плода, специфика которой во многом определяется сроком беременности.

Предложенный в 1983г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза может быть использован любой тип ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактериальных клонов, библиотек генов или из других источников. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы,выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,1987).

Принципиальная схема полимеразной цепной реакции показана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности,комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав-шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50 С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С, начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двухнитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем в последующих циклах и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро- ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.

Таким образом, при каждом цикле происходит двухкратное увеличение числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами – температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десятков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопраймеры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавляют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раствора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каждого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно,составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первичной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и состав амплификационной смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираются эмпирически.С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка. Разработаны различные варианты автоматического поиска последовательностей ДНК, использование которых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибридизация проходила строго специфично, праймеры не должны содержать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отмечали, что для проведения ПЦР достаточно минимального количества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, углеводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищенной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитогенетических препаратов и, что особенно удивительно, полученные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранившиеся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде специальных руководств и инструкций.Существуют различные модификации ПЦР, которые используются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации,продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих случаях для повышения специфичности праймирования используют систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров,то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в первом раунде участка ДНК.В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР,то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат-ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания заслуживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК. На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить,что реакцию амплификации можно проводить не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементарные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS – polymerase reaction in situ). До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специального температурного режима полимеразных циклов), возможно проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократно будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР,так как этот метод по праву стал один из основных в молекулярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).Возможность очень точного и специфичного выбора участка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых молекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку-лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиолете в виде красной полосы после электрофоретического концентрирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза количество и положение окрашенных полос на геле изменяется в соответствии с положением этих сайтов. Путем электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной матричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также структурные изменения в дуплексах между нормальными и мутантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, наконец, возможно определение полной нуклеотидной последовательности синтезированных молекул с идентификацией всех мутаций в исследуемом районе матричной ДНК.Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преимущественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна-чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК путем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и клонирования потеряли свою актуальность. Без их использования невозможна молекулярная идентификация генов, предшествующая разработке методов молекулярной диагностики с использованием ПЦР.