3. Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.

Одним из наиболее эффективных методов идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является ставший уже классическим метод блот-гибридизации по Саузерну, по фамилии автора Edцuard So-uthern, предложившего данный метод в 1975г . Суть метода заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрикции одной или несколькими рестриктазами, после чего образую-щиеся фрагменты разделяются по молекулярному весу в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченым ДНК или РНК зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридиза-ция - высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. При достаточно длительной экспозиции (в течение несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда (более 10!9 расп/ мин/микроГ) этот метод позволяет выявлять менее, чем 0,1 пикоГ ДНК. Так при использовании зонда размерами в несколько сот оснований уникальная последовательность в 1 000 п.о. может быть выявлена в 10 микроГ геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на радиоавтографе после его экспозиции в течение 12 часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олигонуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение высокомеченых радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость всей процедуры делают её весьма дорогостоящей. Тем не менее, в ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения в том числе и для диагностики генных болезней. В последнее время для этих целей нередко используют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК азотно-кислым серебром. Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре, округлой или продолговатой, соответственно. На рис.1.3 также изображены последовательные этапы этих методов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозерн блот, тогда как Вестерн блот или иммуноблот – это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих методов - дань уважения молекулярных генетиков профессору Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку эксперимен-тальных подходов, используемых для анализа ДНК.В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК зондами не требуется предварительного выделения и очистки ДНК.Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов используются препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение имеет также подбор условий, максимально способствующих процедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответствующими участками определенных хромосом . Гибридизация in situ, является одним из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения, при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутри-хромосомной локализациии уникальных генов в тех случаях, когда имеются соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Согласно последним данным, в экспериментах на специально приготовленных и растянутых интерфазных хромосомах человека разрешающая способность метода FISH может достигать 50 kb, что составляет всего около 1/20 величины среднего хромосомного бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успехом решаются методом FISH.Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-овыми зондами, проводимая на гистологических препаратах, является одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК(Манк, 1990). Подробно с этим и другими современными методом молекулярного и цитогенетического анализа, а также с их многочисленными модификациями и вариантами можно ознакомиться в серии работ, руководств и обзоров (Маниатис и др.,1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).

4. ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.

ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК ограниченного размера, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве зондов используют искусственным образом синтезированные оли-гонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить выделенные из генома последовательности ДНК. Однако значительно чаще такие последовательности предварительно клонируют,чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание (инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бактериальные клетки хозяина . Химерные молекулы ДНК, составленные из фрагментов разного происхождения, носят название рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретрои аденовирусы, а также некоторые другие генетические конс-трукции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от сотен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется, главным образом, способностью вектора удерживать чужеродный фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов плазмидную ДНК.

Плазмиды - это небольшие кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе копий в бактериальных клетках. Открытие плазмид связано с изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Ока-залось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие клеткам устойчивость к различным антибиотикам, и потеря чувствительности инфекционных бактерий к их действию как раз и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются плазмиды с соответствующей генетической информацией. Заметим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штаммы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую поддержание их количества в клетке на определенном уровне -от одного до нескольких сотен плазмидных геномов на клетку.Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клетке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клонирующих векторов заключается во внесении изменений в систему контроля репликации и в добавлении или вырезании генов антибиотикоустойчивости или удобных для клонирования иных генетических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клониро-вания используют плазмиды pBR322, ColE1 или их производные.Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализации уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраивание, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов-лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает кольцевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные методы трансформации бактерий, то есть искусственного введения плазмид в бактериальные клетки. При этом, присутствующие в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в качестве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на соответствующих селективных средах. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чужеродный для бактерий генетический материал может быть получен, практически, в любых количествах. Выделенная из бактерий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертиро-ванный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в качестве ДНК-зондов.Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы.Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с чужеродной ДНК с образованием химерного фага. Чисто технически эта операция проще, чем инсерция в плазмиду. Однако,размеры встраимовой ДНК ограничены пакующей способностью головки фага. Поэтому при конструировании вектора вырезают последовательности фаговой ДНК, не имеющие критического зна- чения для жизнеобеспечения фага. Такой бактериофаг может существовать только в том случае, если в него встроена чужеродная ДНК, по размерам сопоставимая с вырезанной фаговой ДНК. Наиболее удачные конструкции векторов были получены на основе фага лямбда - лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.Многие проблемы молекулярной генетики успешно решаются с использованием экспрессионных векторов, содержащих в своем составе регуляторные последовательности, обеспечивающие син-тез чужеродных белков в клетках хозяина. Так в случае лямбда gt11 фаги могут быть выращены в, так называемых, репликативных условиях, обеспечивающих экспрессию инсертированной ДНК. Так как обычно ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов, то экспрессироваться будет слитый белок, в котором часть полипептидной цепи будет соответствовать маркерному белку, а часть цепи будет транслироваться в соответствии с информацией, заключенной во встроенном фрагменте ДНК. Этот белок может быть идентифицирован путем детекции фрагмента маркерного белка либо с помощью антител к специфическим участкам, кодируемым чужеродной ДНК.В последнее время большое распространение получило клонирование в космидах - конструкциях, обьединяющих в себе преимущества плазмид и фагов. Космиды получены на основе плазмид, но в них введены генетические элементы фага лямбда,отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фаговых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами и могут нести до 40-45 тысяч пар оснований инсертированной ДНК. Все вышеперечисленные векторы используются для клонирования в прокариотических системах.Векторы, пригодные для направленного переноса в эука- риотические клетки, конструируют на основе прокариотических или дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в клетках эукариот, а также используют различные эукариотические вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированные вирусы. При использовании плазмид в ка-честве клонирующих векторов в них вводят вирусные последовательности, ответственные за начало репликации. Введение векторов в эукариотические клетки часто осуществляют путем котрансформации, то-есть одновременно вводят плазмиду и сегмент чужеродной ДНК. Векторные последовательности, введенные в клетки эукариот, могут сохраняться там в течение нескольких дней в виде суперскрученных кольцевых молекул эписом. В редких случаях возможна интеграция экзогенной ДНК в хромосомную ДНК. В этих случаях введенные последовательности устойчиво сохраняются в геноме клеток хозяина и наследуются по менделевскому типу (см. Глава VIII).Для клонирования субхромосомальных фрагментов ДНК, со-держащих целые гены, разработана система дрожжевых минихромосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - artificial yeast chromosomes) конструирют на основе плазмидных векторов, содержащих в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Такие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар оснований.