Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки хозяина. Но прежде всего, определим основные термины. Как уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки назвается трансформацией. Если перенос генов осуществляется с помощью фага, то говорят о трансдукциии. Процесс введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий,облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости мембран используют два разных подхода. В первом случае проводят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае используют краткосрочное физическое воздействие на клетки для создания в мембранах микропор, проходимых для макромолекул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетической трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Вопросам молекулярного клонирования также посвящена обширная литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Маниатис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).

5. Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.

Рассмотрим более подробно методы выделения и идентификации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником этих фрагментов являются искусственным образом сконструированные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в зависимости от специфических особенностей этих последовательностей. Библиотека генов это полный набор клонированных перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выделенной из какого-либо специфического источника. В зависимости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек используют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из отдельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или культивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом обратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиотеках присутствуют не только кодирующие последовательности генов, но также несмысловые внутригенные последовательности -интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. Наиболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со средним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрывающихся последовательностей геномной ДНК человека получается после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть количество клонов с различными инсертированными фрагментами ДНК, определяется размерами исходного генома и необходимостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 - 10!6 различных клонов.Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библиотек генов человека особенно удобны векторы, полученные на основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векторы не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволяет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,используется технология искусственных дрожжевых хромосом-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными районами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиотеках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или космидных библиотеках. Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека сконструирована на основе экспрессионного вектор.Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким образом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в результате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гибридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными антителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки фильтров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК последовательности, комплементарные зонду, или специфические антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных культурах производят именно в тех местах, где произошло потемнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринированию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать большие количества этой ДНК.

6. Секвенирование последовательностей ДНК.

Следующими этапами анализа отобранного и клонированного ДНК фрагмента являются его физическое картирование и определение нуклеотидной последовательности, то есть секвенирование. Методология секвенирования достаточна проста и заключается в том, чтобы получить серию комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,однако, определение нуклеотидной последовательности протяженных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую задачу. Существует два основных метода секвенирования: химическое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -метод Сэнджера. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором – синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так как он более надежный и простой в исполнении. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олигонуклеотидную последовательность, комплементарную определенному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гибридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы. После одновременного электрофоретического разделения этих фрагментов на четырех соседних дорожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит и определена локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК . На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная последовательность всего около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет назад оценивалась в 1$.В качестве модификаций метода Сэнджера используют предварительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвенированы без денатурации и праймирования. Очень эффективной оказалась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки большей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным для массового секвенирования в автоматическом режиме оказалось применение меченых различными флюорохромами дидеоксинуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение в реализации программы Геном человека. По последним данным,разработка автоматических секвенаторов позволила снизить стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффективность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.можно было просеквенировать до 1 млн пар оснований.В последние годы активно разрабатываются принципиально новые, более эффективные и экономичные методы секвенирования. Особенно перспективным на сегоднешний день представляется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так называемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхода в том, что пришивается набор всех возможных вариантов перестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) определенной длины, при этом в случае октануклеотидов количество возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвенируемый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Таким образом, определяется набор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в исследуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение этих октамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет автоматизации процесса.