Несмотря на расхождение данных, большинство ав­торов считает, что преинкубация обязательно необхо­дима, а ее оптимальная длительность подбирается эм­пирически в каждой лаборатории. При этом окно оп­лодотворения для зрелого ооцита достаточно широко, однако преждевременное оплодотворение недозревших ооцитов может негативно повлиять на исход дробления и имплантации эмбрионов.

Помимо фактора времени, в инсеминации важным является и количественный фактор. Количество про­грессивно подвижных сперматозоидов обычно должно составлять 50 - 100 тыс. на 1 мл среды (при культиви­ровании в относительно большом объеме среды) либо на ооцит (при культивировании в микрокаплях под минеральным маслом). Подбирая концентра­цию сперматозоидов при оплодотворе­нии ооцитов in vitro, нужно иметь в виду, что при добавлении менее 50 тыс. активно подвижных сперматозоидов на 1 мл частота оплодотворения будет существенно снижена, а при использовании очень вы­соких концентраций возникают побочные эффекты: полиспермия (проникновение более одного спермато­зоида в ооцит при оплодотворении), снижение жизне­способности полученных эмбрионов (за счет повреж­дения кислородными радикалами, при попадании погибающих или мертвых сперматозоидов, либо воз­действия избыточного количества литических акросомальных ферментов).

Однако это правило реализуется лишь в случае нор­мальной морфологии сперматозоидов, при наличии необходимой концентрации активно подвижных спер­матозоидов в эякуляте, отсутствии дефектов акросомальной реакции или отсутствии больших концентра­ций антиспермальных антител в сперме (MAR-тест менее 50%). При наличии этих и других отрицатель­ных факторов, а также при неудаче оплодотворения в предыдущей попытке ЭКО концентрация сперматозо­идов может быть повышена путем снижения объема среды культивирования (культивирование в микро­каплях, соломках для криоконсервации, микрокапил­лярах), однако это далеко не всегда приводит к жела­емым результатам. Для облегчения проникнове­ния сперматозоида в ооцит клетки cumulus и corona radiata могут быть удалены ферментативно и механи­чески, однако это повышает риск полиспермии.

ОПЛОДОТВОРЕНИЕ – ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

Оплодотворение представляет собой слияние двух гамет - ооцита и сперматозоида, влекущее за собой слияние их гаплоидных наборов хромосом и развитие нового организма.

Зрелый ооцит к моменту оплодотворения пред­ставляет собой одну из наиболее больших клеток ор­ганизма - 110 - 120 мкм в диаметре, окруженную блестящей оболочкой (zona pellucida), несколькими слоями клеток лучистого венца (corona radiata) и большим числом клеток яйценосного бугорка (cumu­lus oophorus). К этому времени в ооците, как прави­ло, уже завершилось первое деление мейоза, в ре­зультате которого отделилось первое полярное тель­це, а второе деление мейоза находится на стадии метафазы. Хромосомы располагаются в ряд, образуя метафазную пластинку, непосредственно под поляр­ным тельцем. На этой стадии в ооците происходит блок мейоза, который снимается лишь при проник­новении сперматозоида.

Зрелый сперматозоид имеет уплощенную гру­шевидную головку длиной около 6 мкм и шириной в экваториальном сегменте около 4 мкм, состоящую главным образом из ядра и акросомы, которая со­держит литические ферменты и расположена в виде шапочки над верхней половиной головки. Хвост сперматозоида имеет длину около 50 мкм и начина­ется от головки в районе шейки, где расположены центриоль и комплекс митохондрий. Митохондрии отвечают за обеспечение энергией процесса движе­ния сперматозоида, осуществляемого хвостом. В структуре сперматозоида нет ничего лишнего, все имеет только одну цель – доставить генетический материал, содержащийся в головке сперматозоида, в ооцит.

Способность сперматозоида к оплодотворению in vivo или In vitro появляется лишь после капацитации, под которой in vivo понимается весь комплекс биохи­мических и ультраструктурных изменений, которые претерпевает сперматозоид, проходя путь через жен­ский половой тракт до встречи с ооцитом. Эти измене­ния затрагивают в основном мембрану головки спер­матозоида. Капацитация in vitro происходит во время обработки и инкубирования спермы до оплодотворе­ния, однако она невозможна при отсутствии в средах для отмывки и культивирования альбумина.

При оплодотворении in vivo в трубе присутствует лишь небольшое количество сперматозоидов, проде­лавших весь долгий путь от влагалища до ампулярного отдела маточной трубы. Для нормального оплодо­творения in vitro их необходимо не менее 50 тыс. на ооцит. Однако при подсчете количества сперматозои­дов, непосредственно атакующих ооцит in vitro, их на­считывается до 2 - 3 тыс. До сих пор неясно, почему количество сперматозоидов должно быть так велико в искусственных условиях. Возможно, это объясняется недостаточной физиологичностью среды либо боль­шим размером массы cumulus у ооцитов, получаемых при ТВП, чем in vivo.

Прежде чем попасть в ооцит, сперматозоид должен преодолеть несколько барьеров. Первым из них явля­ется cumulus, представляющий собой растянутый матрикс, состоящий преимущественно из полигиалуроновой кислоты, с редко расположенными клетками. Преодолеть этот барьер может только капацитированный сперматозоид с интактной акросомой. По мере продвижения внутрь cumulus поведение сперматозои­да изменяется: резко возрастает скорость, двумерные движения становятся трехмерными - наступает фаза гиперактивности. In vitro первый барьер спер­матозоидам помогает преодолевать фермент гиалуронидаза, выделяющаяся при разрушении акросом гибнущих сперматозоидов; однако такая ситуация не является физиологичной.

После прохождения cumulus сперматозоид достига­ет zona pellucida, где происходит его связывание с ре­цептором. В отличие от мышей, рецепторы zоnа pellu­cida которых давно выделены и охарактеризованы, таковые человека до сих пор точно не определены. Имеется предположение, что это так называемый ан­тиген к оплодотворению - FA-1, гликопротеин, кото­рый при добавлении в среду полностью блокирует свя­зывание сперматозоидов с zona pellucida.

Связывание сперматозоида возможно только при интактной акросоме и нормальной морфологии голов­ки, поскольку рецепторы сперматозоида к гопа pellu­cida расположены на акросоме. Затем происходит акросомная реакция - мембрана акросомы и цитоплазматическая мембрана ооцита сливаются, содержимое акросомы (главным образом, фермент акрозин, спо­собный к локальному растворению гликопротеинов, из которых состоит гопа pellucida) выбрасывается в месте связывания с гопа pellucida и сперматозоид ин­тенсивно продвигается сквозь оболочку ооцита, все еще находясь в фазе гиперактивности.

Попадая в перивителлиновое пространство, спер­матозоид прикрепляется к рецепторам на мембране ооцита комплементарными рецепторами, расположен­ными на экваториальной части головки под акросо­мой. Связывание сперматозоида с рецепторами на плазматической мембране мгновенно вызывает так называемую кортикальную реакцию - массовый экзоцитоз гранул, расположенных по периферии ооцита (cortex}, что приводит к необратимым измене­ниям zona pellucida, делающим ее непроходимой для остальных сперматозоидов. Это является основным механизмом предотвращения полиспермии у млеко­питающих. Далее начинается процесс слияния мемб­ран сперматозоида и ооцита, в результате которого сперматозоид целиком как бы заглатывается ооцитом (процесс очень напоминает фагоцитоз).