ГЛАВА 2. Методика исследований.

2.1. Гистологические препараты.

В работе использовались препараты головного мозга (лобный полюс поле 4). Для получения подобных препаратов используется два основных метода изготовления срезов: заливка мозга в парафин и замораживание. Так как мозг содержит от 70 ( в волокнах ) до 80% воды ( в клетках ), то его нужно обезвоживать, заменяя воду заливочным материалом. Для удаления воды можно использовать соединения, обладающие большим сродством к ней ( например, этанол ). Чтобы свести повреждение ткани до минимума, эти соединения используют в возрастающих концентрациях. Тем не менее при обработке мозг уменьшается в объеме почти на 7%.

Затем переходят к просветлению и пропитыванию тканей. Для просветления используют вещества, смешивающиеся как с парафином, так и со спиртом, например ксилол, в который помещают кусочек ткани, вынув его из спирта; при этом ткань несколько раз переносят в свежие порции ксилола, пока весь спирт не замещается ксилолом. Затем ткань помещают в жидкий парафин, в котором она остается до тех пор, пока весь ксилол не будет замещен парафином; этот этап называют пропитыванием. После того как блок затвердеет, залитый мозг готов для изготовления срезов. Для обычного исследования в световом микроскопе толщина срезов не должна превышать 5-8 мкм.

Другой метод- приготовление замороженных срезов занимает гораздо меньше времени, чем изготовление парафиновых срезов. Для их изготовления мозг обрабатывают растворами формалина с сахорозой в возрастающих концентрациях. В целом замороженные срезы менее удобны, чем парафиновые, так как кристалики льдаа повреждают ткань. Замороженные тткани не удается нарезать так же тонко, и толщина приготовленных из них срезов обычно достигает 10 мкм.

Поскольку различные компаненты живых клеток имеют сходные опттические плотности, все они уменьшают амплитуду проходящих через них световых волн примерно в одинаковой степени, так что ни один из них не кажется темнее или светлее других. Поэтому для создания достаточного контраста между разными компанентами клеток и тканей, позволяющего исследовать их в обыкновенном световом микроскопе, используют метод окрашивания. Красители поглощаются разными компанентами клеток и тканей в различной степени и могут создавать контрастность различными способами. Обычно используют два красителя: сначала одним окрашивают часть компанентов в один цвет, а затем другим окрашивают остальные компаненты в контрастный цвет.

2.2. Система анализа изображений.

Основными методами исследования нервных тканей являются удаление, стимуляция, электрическая регистрация, химический и гистологический анализ. Например:

а) Расположение нервных структур, отвечающих за определенное поведение, может быть установлено путем максимального удаления участков мозга, при котором это поведение сохраняется, и/или путем минимального удаления, при котором оно исчезает. Той же цели может служить и функциональная блокада нервных центров.

б) Нервный субстрат реакции можно проанализировать путем нахождения области и максимальных параметров электрической и химической ее стимуляции, вызывающих такую же реакцию.

в) Электрическая активность, сопровождающая поведенческий акт, может отражать процессы, важные для его реализации. Электрофизиологические методы могут использоваться для выявления распространения афферентных импульсов в мозге, активности, предшествующей возникновению внешней реакции, или для соотнесения вероятности и/или величины поведенческой и электрической реакции.

г) Активация и возможная модификация нервных цепей, вызванная обучением, может отражаться в локальных изменениях метаболизма медиаторов, нуклеиновых кислот и белков.

д) Гистологическое описание позволяет качественно охарактеризовать структуру ткани и получить ее количественные характеристики, что позволяет строить математические модели по различным функциональным процессам в исследуемой ткани.

2.2.1.Основы математической обработки изображений.

Важную роль в гистологическом исследовании играет анализ изображений. Геометрические измерения анализа изображения появились из основных понятий стереологии [16], поэтому они активно используют понятия и методы этой науки. Основными геометрическими понятиями являются площадь, периметр, центр масс, моменты инерции и ориентация объекта. Изображение в памяти вычислительной техники дискретно и представляет набор пикселов, что вносит определённые поправки в измерения. Алгоритмы вычисления площади и периметра описываются на модели дискретизации [3]. В соответствии с этой моделью любая плоская непрерывная кривая представляется на дискретном растре с шагом дискретизации h множеством точек растра, для которых выполняется одно из следующих условий:

1) расстояние от точки растра до ближайшей точки пересечения кривой с некоторой линией растра, проходящей через эту точку меньше 0,5h.

2) если это ближайшее расстояние равно 0.5h, то есть кривая пересекает линию растра ровно по середине, говорят, что кривая содержит точку неопределённости и любая из них включается в дискретное представление кривой.

Чтобы избежать трудоёмкого просмотра контурных точек, для вычисления площади используют теорему Пика [3]: площадь произвольного треугольника со всеми вершинами в узлах ортогональной решетки равна сумме числа точек растра, лежащих внутри многоугольника и половины числа контурных точек, уменьшенной на единицу:

где - число внутренних точек фигуры; - число точек принадлежащих контуру фигуры:

.

Из описанной выше модели и определённых упрощений вытекает и формула для периметра [3,16,17]:

где - контурные точки только по горизонтальной оси, - по вертикальной оси, - одновременно по обоим осям.

Все остальные параметры легко вычисляются с помощью рассмотренных выше [2,7,9,11,16,17].

Важным моментом измерения является оценка или классификация объектов измерения. Необходимо различать четыре общих уровня измерения или оценки: номинальный, ординальный, интервальный и соотносительный. Низшим уровнем является номинальный, где такие символы, как буквы или цифры, используются просто для классификации объектов или явлений. В этом случае количество измерений, попадающих в различные классы в условиях эксперимента и контроля, сравниваются с использованием биномиальной статистики. Если возможно упорядочить наблюдения так, чтобы они находились в каких то отношениях ( например, ²больше чем ², ²меньше чем² и т.д.), то будем иметь дело с ординарной шкалой. Если , кроме того, можно обнаружить интервалы между числами на такой шкале, то будем иметь дело с интервальной шкалой, которая имеет произвольную нулевую точку( как в случае температурной шкалы). Если же шкала имеет еще и истинную нулевую точку в начале, как, например, шкалы высоты, массы, то будет достигнут наивысший уровень измерения, то есть соотносительная шкала. Параметры, измеряемые с помощью номинальной или ординарной шкалы, обрабатываются с применением непараметрической статистики, тогда как данные, измеряемые по интервальной и соотносительной шкале, кок правило, обрабатываются с помощью параметрических статистических методов. Параметры популяции, подвергаемые непараметрическим статистическим процедурам, не обязательно должны соответствовать определенным условиям, например, нормальному распределению.