Следует отметить, что тип распознавания апоптотирующих клеток макрофагами может сильно зависеть от типа клеток и от стадии процесса программированной гибели [Исаева М.П. и соавт.,1998].

1.3.4. Гены, участвующие в апоптозе

Некоторые гены важны для программирования клеток к гибели, другие необходимы для окончательного удаления мертвых клеток и, наконец, четыре гена непосредственно участвуют в процессе апоптоза [Akbar A. N. e. a., 1993].

Продукт гена nuc-1 является эндонуклеазой, расщепляющей ДНК в мертвых клетках. Клетки с мутацией в nuc-1 погибают без деградации ядерной ДНК. Неизвестно существует ли сходство между продуктом nuc-1 и Са2+Мg2+зависимой нуклеазой [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961].

Два гена- ced-3 и ced-4- необходимы для клеточной гибели. При мутациях в этих генах клетки, обычно запрограммированные на гибель, выживают. Показано, что ced-3 является протеазой, а ced-4 содержит Са2+Мg2связывающий домен. ced-9 кодирует белок, предотвращающий гибель клеток, индуцированную ced-3 и ced-4 [Akbar A. N. e. a., 1993,].

1.3.5. Необходимость изучения апоптоза

Отметим ряд наиболее важных для фармакологии направлений для изучения апоптоза.

Во-первых, поиск и разработка препаратов, угнетающих апоптоз. Клиническую перспективность могут иметь препараты, блокирующие апоптоз, индуцированный некоторыми вирусами и суперантигенами. Очевидно, что такие антиапоптотические препараты будут представлять собой первый класс иммуностимуляторов. Теоретически, ингибиторы апоптоза пригодны для лечения ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз, инсульт, травмы мозга, инфаркт миокарда [Marmur J.,1961]. Индукторы апоптоза необходимы прежде всего для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных расстройств [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Особый интерес представляют исследования, касающиеся изучения процессов запрограммированной клеточной гибели при ИМ. Исследование морфологии и анализ ДНК Т-лимфоцитов позволили установить, что вирусный интерлейкин-10 (продукт репликации EBV) ингибирует потерю клетками объема, уплотнение хроматина и фрагментацию ДНК, характеризующие апоптоз [Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992], напротив, при остром ИМ было зарегистрировано повышение Т-клеток с признаками апоптоза. Известно, что некоторые цитокины типа интерлейкинов 2, 5, 6 могут препятствовать апоптозу Т-лимфоцитов [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Исходя из этого, авторы предположили, что апоптотическая гибель большинства Т-лимфоцитов была связана с их миграцией из участков, активно продуцирующих данные факторы, в результате антигенного воздействия, то есть апоптоз Т-клеток представляется авторами как механизм антигенуправляемой селекции лимфоцитов [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961]. Увеличение числа апоптотических Т-лимфоцитов (APS) при ИМ также наблюдали Y. Matsuoka e. a. [1997]. Уровень APS повышался на ранней стадии ИМ и нормализовался с уменьшением числа атипичных лимфоцитов. Авторы предполагают, что апоптоз Т-клеток при ИМ способствует восстановлению части поврежденных вирусом В-лимфоцитов [Taga H. e. a. , 1994].

Wagner e. a. [1995] показано, что стимуляция апоптоза в EBV-преобразованных лимфоцитах осуществляется Т-лимфоцитами, экспрессирующими BLT-экстеразу. Защиту В-лимфоцитов от апоптотической гибели обеспечивают экспрессируемые ими мембранные белки -LMP1 и BHRF1, кодируемые EBV [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Защита осуществляется через регуляцию bcl-2-экспрессии лимфоцитами. Bcl-2 proto-oncogen кодирует внутренние митохондриальные белки, блокирующие запрограммированную гибель клеток, в связи с чем регулирование LMP1 и BHRF1 экспрессии. bcl-2 определяет живое состояние и гибель клетки. LMP1 предотвращает апоптоз, индуцируемый анти-fas-антителами, а BHRF1- анти-Pa8-антителами и TNF-a [Akbar A. N. e. a., 1993].

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что апоптоз при ИМ служит механизмом, регулирующим численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях инфекционного процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, ИМ- доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, достоверным диагностическим критерием которого являются изменения в системе крови. Своеобразным маркером заболевания служат “атипичные мононуклеары”, представляющие собой трансформированные под действием вирусных антигенов лимфоидные клетки. Одним из механизмов ограничения лимфопролиферативности процесса при ИМ является апоптоз, который регулирует численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях инфекционного процесса.

Однако литературные данные, касающиеся апоптотических реакций клеток в норме и при патологическом состоянии, и при ИМ в частности, немногочисленны и фрагментарны, что и послужило причиной настоящего исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материал и объект исследования

Нами были обследованы дети, в возрасте от 7 до 14 лет, больные ИМ (инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр) средней степени тяжести, острым и гладким течением и ОИЗ с МПС (цитомегаловирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом герпеса, иерсиниоз, различные формы ангин-фоликулярная, лакунарная, некротическая) в период развернутой клинико-гематологической картины заболевания (1 группа больных), в период реконвалесценции (2 группа больных) и в катамнезе (3 группа больных). Диагноз заболевания устанавливали по характерной клинико-гематологической картине заболевания и лабораторным данным. Диагноз ИМ во всех случаях подтверждали выявлением в сыворотке больных ДНК вируса Эпштейна-Барр методом полимеразной цепной реакции (отдел молекулярной биологии ЦНИЛ СГМУ) и антител к антигену вируса Эпштейна-Барр (Ig A, M, G к вирусному капсидному антигену, Ig G к раннему антигену) с помощью непрямой иммунофлюоресценции (лаборатория онковирусологии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН).

Все дети, больные ИМ находились на лечении в инфекционных отделениях в 3 горбольницы г.Томска и в больницы им. Г.Е.Сибирцева.

Контрольную группу составили условно здоровые дети аналогичного возраста. Материал исследования – периферическая кровь. Забор крови осуществляли из локтевой вены, утром, натощак.

Распределение обследованных детей в зависимости от методов и сроков исследования можно наблюдать в табл. 1.

2.2. Исследование апоптоза лимфоцитов

2.2.1. Индукция апоптоза лимфоцитов in vitro

В пробирку вносили 0,4 мл плазмы гепаринизированной крови( 25 Ед/мл) и 2 мл солевого раствора Дульбекко, не содержащего Ca2+ и Mg2+(‘Sigma’, США). Контролем служила суспензия, состоящая из 0,4 мл плазмы гепаринизированной крови(25 Ед/мл) и 2 мл солевого раствора Дульбекко с 10 % ЭТС. Пробы инкубировали при 37 С в течение 6 часов.

2.2.2. Выделение ДНК лимфоцитов

1. В чистые полипропиленовые пробирки типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл вносили 3 мкл носителя и 450 мкл денатурирующего раствора. Добавляли 450 мкл исследуемой сыворотки или плазмы крови, используя наконечники с фильтрами. Тщательно перемешивали на вортексе в течение 10 секунд. Затем инкубировали при комнатной температуре 10 минут. После этого центрифугировали 15 секунд при 12 тыс. об/мин, добавляли 100 мкл хлороформа и перемешивали на вортексе 5 секунд. Далее вновь центрифугировали при 12 тыс. об/мин 10 минут. Переносили до 300 мкл верхней фазы в чистую полипропиленовую пробирку, содержащую 300 мкл изопропилового спирта, перемешивали на вортексе 5 секунд. Чтобы избежать контаминации, данную процедуру проводили используя наконечники с фильтрами. После этого центрифугировали при 12 тыс. об/мин 15 минут. Удаляли супернатант, используя водоструйный насос, в колбу-ловушку. К осадку добавляли 1 мл промывочного раствора, перемешивали и вновь центрифугировали при 12 тыс. об/мин 5 минут. Далее как можно тщательнее удаляли супернатант, осадок подсушивали 10-20 минут, добавляя 30 мкл деионизированной воды, закрывали пробирки, инкубировали 10 минут при комнатной температуре, перемешивали встряхиванием.