Величину рН определяли потенциометрически на рН-метре ЛПУ-01. Для измерений значений рН растворов в температуре отличной от 20oС, применяли автоматическую компенсацию.

2.2 Метод определения протеолитической активности.

Протеолитическую активность (ПА) определяли по ГОСТ 20264.2-74 [12]. Субстратом служил 2% раствор казеината натрия, к которому добавляли 2см3 раствора фермента и помещали в ультратермостат при температуре 30oС. После проведения гидролиза в течение 10 минут в опытную пробирку приливали 4см3 раствора трихлоруксусной кислоты. Выдерживали ещё 20 минут при температуре 30oС. Затем фильтровали в сухие пробирки. К 1см3 фильтрата добавляли 5см3 0,5М раствора карбоната натрия, перемешивали и добавляли 1см3 рабочего раствора Фолина. Через 30 минут измеряли оптическую плотность раствора на ФЭКе КФК-2 при 670 нм в кюветах с поглощающим свет слоем 10 мм против контроля. За единицу ПА принимают такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30oС катализировало переход в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 ммолю тирозина (1ммоль тирозина равен 0,181мг).

2.3 Определение коллагеназной активности.

Коллагеназную активность определяли по содержанию оксипролина в смеси, образовавшегося в результате действия фермента на нативный коллаген. С этой целью готовили реактив для окисления: 28,2 г хлорамина Т растворяли в 40см3 воды для получения 0,05М концентрации, добавляли 60см3 ацитат-цитратного буфера с рН 6,0. К 2см3 анализируемой пробы, содержащей 2 - 20 см3 оксипролина, приливали 1мл реактива для окисления, встряхивали и оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Затем в смесь вносили 2 – 1 см3 4М хлорной кислоты, встряхивали и через 5 минут приливали 3см3 10% раствора n-диметиламинобензальдегида в метилцеллосольфе. Пробу нагревали 15 минут в водяной бане при 150оС и после охлаждения фотометрировали с зелёным светофильтром на ФЭК-56М (555нм).

Гидролиз коллагена вели в следующих условиях: 20 мг нативного коллагена обрабатывали исследуемым ферментным препаратом в присутствии буферной системы с рН 7,0 так, чтобы общий объём составил 25см3. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37oС. Контролем служили пробы, инкубированные в тех же условиях, но без фермента, предварительно остановив реакцию внесением 0,5см3 этанола и центрифугированием смеси в течение 15 минут при 6000 ч×мин-1.

Активность коллагеназы выражали либо в ммолях оксипролина на 1 мг белка за 60 минут, либо в процентах растворения.

2.4 Определение молекулярной массы фермента.

Молекулярную массу определяли с помощью гель-фильтрации на сефадексе У-100. Расчёт проводили по формуле:

LgM=5,941-0,847 (V/V0),

где V – объём выхода фермента;

V0 – свободный объём колонки.

2.5 Определение содержания аминного азота.

Метод основан на образовании цветного комплекса при взаимодействии аминогрупп аминокислот с гидроксидом меди. В пробирку, содержащую 100 мг сухого медного реактива, вносили 4см3 анализируемой пробы, предварительно нейтрализованной сухим бикарбонатом натрия, выдерживали 15 минут периодически встряхивая. Затем центрифугировали и измеряли оптическую плотность на ФЗКе КФК-2 при 590 нм. В контроле вместо 4см3 пробы присутствовало 4см3 дистилированной воды. Содержание аминного азота рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для известных аминокислот.

2.6 Электрофоретические исследования.

2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов.

Электрофорез проводили по методу Дэвиса на приборе фирмы Reanol (Венгрия) в щелочной буферной системе, рН 8,9. Концентрация акриламина в мелкопористом геле составила 5%. Длина мелкопористого геля в трубочке составила 5,5 см. Растворы для полимеризации готовили обычным способом. Исследуемый образец, содержащий 20 – 30 мкг белка смешивали в соотношении 1 : 1 с 40% раствором сахарозы и наносили на трубочку с гелем. Объём образца не превышал 0,2 см3. Поверх образца осторожно наслаивали электродный буфер, который содержал в 1 л 0,6 г трис-(гидроксиметил)-амино-метана и 2,88 г глицина.

В верхний резервуар прибора вносили 1 см3 0,001% раствора бромфенолсинего для контроля за движением фронта подвижных ионов. В первые 10 – 15 минут сила тока составила 1мА на трубочку, а затем 2,5мА. После окончания электрофоретического разделения гели вынимали из трубочек и проводили окрашивание. Окрашивание проводили раствором амидочерного с массовой долей 0,5, приготовленного с массовой долей 7 уксусной кислоты. Окрашивание проводили 20 – 30 минут. Краситель отмывали с массовой долей 7 уксусной кислотой с многократной сменой раствора.

2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ [16].

Для проявления в гелях полос с протеиназой их выдерживали в денатурированном растворе гемоглобина 2% концентрации в течение 15 – 30 минут при температуре 30oС. Затем промывали несколько раз дистиллированной водой и переносили в раствор амидочерного. Проводили окрашивание в течение 20 – 30 минут. Краситель отмывали 7% уксусной кислотой. Если в гелях присутствовала протеиназа, то появлялись белые полосы.

Все опыты, описанные в работе, проводили 3 –4 раза, аналитические определения для каждой пробы проводили в двух – трёх повторностях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из двух или трех определений. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕИНАЗЫ

PENICILLIUM WORTMANNII 2091 И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

Известно, что микроорганизмы синтезируют богатые набором ферментов комплексы. Поэтому важным этапом в получении препаратов направленного действия является изучение условий их выделения, очистки от сопутствующих биологически активных и баластных веществ. В связи с малой изученностью представителей грибов Penicillium этот этап представляет особую важность.

3.1 Разработка условий выделения препарата

Penicillium wortmannii BKMF 2091.

Для выделения ферментов из различных сред в лабораторных условиях и в промышленности чаще всего применяют органические растворители и нейтральные соли.

Эффект осаждения белков органическими растворителями, как известно [7], основан на явлении уменьшения сольватации полярных групп фермента. Молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности белка, могут быть замещены на молекулы органического растворителя. При этом растворимость белков падает, происходит агрегирование и осаждение белковых молекул.

В качестве осадителей использовали 96,5% этанол, 98,0% изопропанол, химически чистый ацетон и сульфат аммония. Органические растворители и сульфат аммония добавляли к охлажденной до 0 – 4oС культуральной жидкости Pen. Wortmannii 2091 при различных значениях рН и постоянном перемешивании. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, растворяли в небольшом объёме дистиллированной воды и определяли протеолитическую активность.