Поскольку инактивация протеиназы была необратимой, для определения энтальпии DН¹, свободной энергии DF¹ и энтропии DS¹ воспользовались теорией абсолютных скоростей Эйринга.

При повышении температуры скорость инактивации возрастает. Это можно объяснить тем, что тепловая энергия разрушает гидрофобные взаимодействия, которые играют важную роль в стабильности белков. В результате происходит развёртывание полипептидной цепи, что подтверждается высокими значениями DS¹ и согласуется с литературными данными.

Таким образом, изменение величины рН вызывает разрушение электростатических сил, и решающую роль в этих условиях в процессе инактивации играют, по-видимому, гидрофобные взаимодействия.

3.6 Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента.

Главным признаком, используемым при отношении протеолитических ферментов к тому или иному классу, является строение каталитического центра.

Отправной точкой в изучении строения активного центра, механизма катализа является идентификация функциональных групп, что достигается комплексными исследованиями и, в первую очередь, применением специфических ингибиторов. В наших опытах в качестве ингибиторов были использованы ЭДТА, монойодуксусная кислота, n-хлормеркурийбензоат натрия, фенилметилсульфатонилфторид, диизопропилфторфосфат, перманганат калия.

Растворы ферментов, содержащие 5×10-3М этих соединений, выдерживали при 30оС в течение одного часа.

Как показали результаты опытов, протеиназа 1 полностью инактивировалась ЭДТА – ингибитором металлоферментов, остальные ферменты не изменяли протеолитическую активность.

Протеиназа 2 инактивировалась монойодуксусной кислотой и n-хлормеркурийбензоатом натрия на 84 и 63% соответственно. Фермент терял активность при воздействии фенилметилсульфатонилфторидом и диизопропилфторфосфатом, это даёт возможность предположить, что протеиназа 2 относится к «сериновым». Не оказывал влияния не на одну из протеиназ перманганат калия, что свидетельствует об отсутствии в активном центре карбоксильной группы.

На основе полученных данных можно предположить, что протеиназа 1 относится к «металлоферментам», а протеиназа 2 – к «сериновым».

В дальнейшем было интересно рассмотреть влияние на протеиназы гистидина. На протеиназу 2 он не оказывал ингибирующего действия, в то время как полностью ингибировал протеолитическую и коллагеназную активности протеиназы 1. Из литературы известно, что гистидин является ингибитором коллагеназ. В связи с чем очевидно, что протеиназа 1 является ферментом, проявляющим свойства протеиназы с коллагеназным действием

К специфическим реагентам относятся также ионы металлов. Они могут оказывать ингибирующий или активирующий эффект. В наших опытах мы использовали соли двухвалентных металлов в виде хлоридов и концентрации 0,005М. Фермент выдерживали в соли, а затем определяли остаточную активность. Ионы Mn2+, Ca2+, Ba2+ практически не оказывали никакого влияния на активность обеих протеиназ; Zn2+, Co2+ незначительно ингибировали оба фермента, ионы Cd2+, Cu2+ ингибировали протеиназу 1, а протеиназа 2 ингибировалась ионами Fe2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+ . Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Влияние ионов металлов на активность протеиназ Penicillium wortmannii 2091.

3.7 Субстратная специфичность.

В изучении протеолитических ферментов значительное место занимают исследования специфичности их действия. В литературе нет сведений, касающихся вопроса специфичности действия протеиназ грибов рода Penicillium. В связи с этим исследовалась способность протеиназы 1 к гидролизу некоторых пептидных связей.

Исследования проводили на синтетических пептидах и различных белках. Результаты показали, что протеиназа 1 гидролизовала довольно широкий спектр пептидных связей. Она разрывала связи в пептидах: цис – ала, про – ала, гли – лей, гли – мет, ала – гли – гли, ала – гли – фен. Следует отметить, что гидролизу подвергались связи, характерные для белков животного происхождения. В связи с этим мы исследовали специфичность действия протеиназы на животных белках. В качестве субстратов использовались: казеин, гемоглобиин, денатурированный мочевиной, кератин, коллаген, желатина. При одной и той же концентрации фермента наиболее активно расщепляется казеин (78 – 80%) и гемоглобин (60 – 62%), затем слабее желатина и коллаген. Менее всего гидролизу подвергается кератин (22 – 25%) (рис.5).

3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья: ноги птиц, шквара.

Мясная промышленность располагает значительным количеством шквары, получаемой при перетопке говяжьего и свиного жиросырья. Анализ химического состава шквары свидетельствует о значительном содержании в ней белковых веществ и подтверждает целесообразность её использования как в колбасном, так и ряде других производств. Общее содержание белка в шкваре колеблется в пределах 65 – 80%. В состав белков входят 22 – 44% коллагена и 19 – 30% эластина. Однако использование шквары ограничивалось из-за большого содержания соединительной ткани. В настоящее время соединительную ткань рассматривают не как билластное вещество, а как необходимый компонент питания [10]. В связи с этим возрастает практический интерес к рациональному и полному использованию шквары на пищевые цели, разработке путей повышения её биологической ценности. Это направление явилось основой разрабатываемой нами темы.