Куриные эмбрионы заражают в желточный мешок или хорион-аллантоисную оболочку, Яйца должны быть получены от кур, в рацион которых не добавляли антибиотики. Оптимальный возраст эмбрионов для заражения 6-7 суток. Доза для заражения составляет 0,2 - 0,5 мл исследуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37°С и овоскопируют ежедневно. Гибель эмбрионов в 1-ые двое суток считают неспецифической. Специфическая гибель их начинается на 3 - 4-ые сутки и может регистрироваться до 10 - 12-ого дня.

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12-й день вскрывают и проводят пассаж по описанной выше методике. Рекомендуется проводить не менее трех последовательных пассажей, используя при этом центрифугат 10 - 15% суспензии желточных мешков.

Погибшие эмбрионы вскрывают, желточные мешки отбирают и готовят из них препараты-отпечатки. Аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высева на обычные питательные среды.

Препараты окрашивают и микроскопируют. Результат считают положительным в случае обнаружения хламидий в препаратах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов любого из 3-х пассажей.

Хламидии из исследуемого материала можно выделять путем внутрибрюшинного, интраназального, интрацеребрального, интраторакального заражения морских свинок. Наиболее приемлемым является внутрибрюшинный способ заражения в дозе 0,5 мл 10%-ной суспензией паренхиматозных органов, приготовленной по методике описанной выше (как для заражения куриных эмбрионов).

Лабораторные животные гибнут на 5 - 10 сутки после заражения. В случае выживания животных, их убивают, из паренхиматозных органов делают 10%-ную суспензию, которой заражают новую партию морских свинок. Необходимо провести не менее 3-х последовательных пассажей, как и на куриных эмбрионах.

Результат исследования считают положительным при обнаружении хламидий в препаратах-отпечатках из органов павших лабораторных животных в любом из 3-х последовательных пассажей с помощью световой и люминесцентной микроскопии.

Для культивирования хламидий используют первичные и перевиваемые культуры клеток (McCoy, L-929, HeLa). Заражение культуры клеток проводят материалом, полученным соскобом со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Исследуемый материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими: 2 мл среды 199 с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 45% 0,5М раствора глюкозы. Для подавления бактериальной микрофлоры в исследуемый материал добавляют стрептомицин (200 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками составляет от 3 до 18 часов, при температуре 4°С, после чего материал вносят по 0,3 мл в пробирки с монослоем клеток. На каждую пробу используют не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Одновременно ставят контроли:

контроль монослоя в норме;

контроль монослоя, инфицированного эталонным штаммом;

контроль монослоя, зараженного экстрактом ткани аналогичной исследуемому материалу, но не содержащей хламидий.

Культуры клеток ежедневно микроскопируют с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД).

Серологический метод

Хламидии имеют групповой термостабильный антиген, который выявляют в серологических реакциях: РСК, РДСК, РНСК, РНГА, ИФА. Наибольшее применение в практике получила РДСК, основанная на выявлении специфических антител в сыворотке крови абортировавших животных (нарастание титра в 2 и более раза). Абортировавших свиноматок исследуют дважды. Кровь от свиноматок берут в день аборта и спустя 21 день после него. С помощью РСК проводят массовое обследование поголовья, что позволяет выявлять бактерионосителей и оценивать эпизоотическую ситуацию в хозяйстве. Наличие комплементсвязывающих антител к хламидийному антигену в низких титрах – показатель инфицированности животных.

Постановку РДСК осуществляют согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных», утвержденным ГУВ МСХ СССР 15.04 1986 г. Для постановки РСК Российский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности выпускает «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных».

В Республике Беларусь разработаны «Методические указания по постановке реакции непрямого связывания комплемента при серологической диагностике хламидийных инфекций у животных» (Фомченко И.В., Максимович В.В., Тюликов С.И.).

В случае нарастания титра антител при исследовании в РНСК парных проб сывороток в два и более раза диагноз считается установленным серологическим методом.

Иммуноферментный анализ применяют для ретроспективной диагностики хламидиоза. Используют твердофазный метод в направлении идентификации антигена и антител.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.

Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

Молекулярно-генетический метод.

Метод предназначен для выявления ДНК хламидий с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в патологическом материале от животных.

Суть ПЦР заключается в амплификации, т.е. увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК или РНК (праймеров) искомого агента in vitro с последующей индикацией амплификона (амплифицируемый участок ДНК) методом электрофореза или другим методом.

ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель в количестве 1 бакт. клетки в пробе, специфичность 100%.

Идентификация хламидий

Идентифицируют хламидии и их антигены методами световой и люминесцентной микроскопии (РИФ), в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА или с помощью ПЦР.

Диагноз на хламидиоз считают установленным в одном из следующих случаев:

1. При выделении возбудителя из исследуемого материала и его идентификации;

2. При получении нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови больных или переболевших животных в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА в два и более раз;

3. При выявлении ДНК хламидий в ПЦР.

При диагностике хламидиоза предусмотрены следующие сроки исследований: