Получение трансгенных животных
В сочетании с пересадкой трансформированных половых клеток в семенники реципиентов и успешным протеканием сперматогенеза подход может быть использован для получения трансгенного потомства.
Не смотря на хорошие результаты в использовании сперматозоидов для получения трансгенных мышей, а так же отдельные успешные попытки получения трансгенных свиней и КРС [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], каких-либо значительных успехов в получении трансгенных сельскохозяйственных животных с помощью трансформированных сперматогониев и спермиев до настоящего времени достигнуто не было. Достижения в использовании трансгенных технологий.
|
Год |
Событие |
Автор |
|
1971 |
Доставка чужеродной ДНК в ооциты кролика сперматозоидами |
Bracket |
|
1974 |
Получение трансгенных мышей с помощью вирусных векторов |
Jaenish, Mintz |
|
1976 |
Передача трансгена по наследству |
Jaenish |
|
1980 |
Получение трансгенных мышей микроинъекцией |
Gordon |
|
1981 |
Получение стволовых клеток |
Ewans, Kaufman, Martin |
|
1984 |
Эмбриональные химеры из клеток тератокарциномы |
Bradley |
|
1985 |
Получение трансгенных сельскохозяйственных животных |
Brem, Hammer |
|
1986 |
Эмбриональные химеры с использованием ЭСК Получение овец посредством пересадки ядер |
Gossler, Willadsen |
|
1987 |
Гомологичная рекомбинация в ЭСК Получение КРС методом пересадки ядер |
Thomas, Capeccha Brather |
|
1988 |
Получение кроликов методом пересадки ядер |
Slice и Robl |
|
1989 |
Генный таргетинг у мышей Получение трансгенных мышей и свиней с помощью спермиев в качестве векторов Получение трансгенного КРС методом микроинъекции Получение свиней методом пересадки ядер |
Thompson el al., Lavitrano el at.,Gandolfi et al. Roschlau el al., Prather et al., |
|
1995 |
Получение трансгенного КРС с помощью спермиев |
Schelander et al |
|
1996 |
Получение овец методом пересадки ядер культивируемых эмбриональных клеток Получение ЭСК приматов |
Campbell Thomson |
|
1997 |
Получение овец методом пересадки ядер фетальных клеток и соматических клеток взрослого животного Получение трансгенных овец методом пересадки ядер трансформированных культивируемых клеток Получение химерных трансгенных свиней, с использованием ПЗК |
Wilmutetal, Schnieke Piedrahita |
|
1998 |
Получение трансгенного КРС методом пересадки ядер трансформированных фетальных фибробластов Получение трансгенного КРС с использованием псевдотипных ретровирусных векторов Получение ЭСК из бластоцист человека Получение мышей методом инъекции в цитоплазму ядер кумулюсных клеток Получение КРС методом пересадки ядер дифференцированных клеток |
Cibelli Chan Thomson Wakayama Kato |
|
1999 |
Получение трансгенных мышей методом коинъекции ооцитов спермиями и экзогенной ДНК |
Perry |
|
2000 |
Получение свиней методом пересадки ядер соматических клеток (клетки гранулезы) |
Polejaeva |
2. ФАКТОРЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ТРАНСГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ
Наряду с низкой эффективностью большинства методов трансгенеза основным лимитирующим фактором получения трансгенных является случайный характер интеграции трансгена в геном. На экспрессию трансгена в организме животных оказывают влияние последовательности, прилегающие кв участку интеграции, что является причиной большой вариабельности уровня экспрессии. Уровень синтеза трангенного продукта может варьировать у различных животных от эктопного до слабого или даже находится ниже порога детекции.
Влияние участка интеграции на уровень и характер экспрессии объясняется так называемым позиционным эффектом [Wilson era/., 1990, Sippel et al., 1997). Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmlter, Brinster, 1986].
Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий.
Первым таким подходом, позволившим увеличить уровень экспрессии, являлось введение в генные конструкции гомологичных интронных последовательностей.
Положительное влияние на уровень экспрессии трансгенов оказывало введение в генные конструкции S/MAR-элементов
Наиболее удачным решением проблемы преодоления позиционного эффекта явилось интеграция в определенный участок генома посредством гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках, так как это обеспечивает контроль трансгенной конструкции всеми регуляторными последовательностями, присутствующими в выбранном эндогенном локусе. Оптимальная локализация трансгенов в геноме клетки хозяина может быть выбрана исходя из уровня и характера экспрессии экспериментального трансгена. Еще одним подходом, позволившим дайной интеграции трансгена в геном хозяина является включение в генные конструкции всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию. Стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не могут быть использованы, вследствие их ограниченной емкости. Данная стратегия может быть использована с применением векторов типа искусственных хромосом, обладающих повышенной клонирующей способностью.
