1.3 Метод пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro

Еще одним способом получения трансгенных млекопитающих является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы как стволовые клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Впервые экспрессия генных конструкций в соматических тканях химерных мышей, полученных с использованием трансформированных клеток эмбриональной карциномы, была доказана Stewart с соавторами [1985]. Доля химерных мышей была очень высокой, причем часть из них передавала трансген по наследству. Однако в настоящее время наибольшее распространение для получения химерных животных получили эмбриональные стволовые клетки, ЭСК [Robertson et al., 1986]. Преимуществом получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Это означает, что каждый эмбрион, развившийся в культуре после пересадки ядер, будет трансгенным и последующая селекция трансгенных эмбрионов не требуется. Кроме того, пересадка таких эмбрионов реципиентам приведет к рождению только трансгенного потомства. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК делает возможным в ряде случаев проводить оценку экспрессии трансгенов, что имеет немаловажное значение. При микроинъекции трансгены наугад интегрируются в любую часть генома. Это означает, что они могут разрушать весьма существенные гены (инсерционные мутации) или размещаться в тех частях хромосомы, которые недоступны для транскрипции. Тестирование экспрессии в культуре сделает возможным использование для пересадки ядер, а следовательно и для получения трансгенных животных только тех клеточных линий, в которых трансгены являются транскрипционно и трансляционно активными. Кроме того, в отличие от метода пронуклеарной инъекции исследование ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного хххххххххх

Сенсационное сообщение было опубликовано в 1996 году в Nature. Была продемонстрирована возможность получения жизнеспособных овец посредством пересадки ядер соматических клеток, культивируемых in vitro. Позже сообщили о получениитрансгенных овец посредством пересадки ядер стабильно трансформированных первичных фетальных фибробластов (Schnieke et al., 1997). Из шести полученных трансгенных ягнят пять оказалось жизнеспособными. Степень трансгенности при использовании данной, метода составляла 100%, в то время как применение метода микроинъекции в той же лаборатории позволяло получить лишь 4,35% трансгенных потомков от числа родившихся животных. Для получения одного трансгенного ягненка методом пересадки ядер требовалось 20,8 овец, в то время как при использовании метода пронуклеарной инъекции - 51,4 овцы [Schnieke et at., 1997]. Как и при использовании ЭСК, данный метод позволяет проводить анализ интеграции в культуре клеток, а также осуществлять целенаправленное встраивание генных конструкций в желаемые участки генома. Кроме того, используемые клеточные линии могут быть кариотипизированы в культуре, что позволит заранее предопределять пол трансгенных животных. После получения трансгенных животных из различных клеточных линий и определения уровня экспрессии может быть произведен отбор желательных клонов для их дальнейшего использования в пересадках ядер.

Схема получения трансгенных животных с использованием стабильно трансформированных клеток.

1.4 Липосомы как переносчики ДНК

Векторами для переноса генных конструкций в эмбриональные линии млекопитающих могут служить липосомы [Rottmann et al, 1985], однако опосредованный ими перенос генов не получили широкого распространения

1.5 Использование половых клеток семенников (спермии и сперматогонии)

Сперматозоиды являются природным вектором, доставляющим ДНК в клетку. Использование спермиев в качестве переносчиков одной ДНК рассматривается как один из перспективных методов генетической модификации животных. В опытах Lavitrano (1989) 30% мышей полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству.

Многочисленные попытки в других лабораториях неуспешными. Анализ 1300 мышей, родившихся in vitro обработанной ДНК спермой, не выявил трансген ни у одной из исследованных особей [Brinster, 1989), Недавнее исследования показали, что при применении метода переноса ДНК посредством сперматазоидов в одной и той же лаборатории дае пра использовании одинаковой схемы исследований могут быть получены противоречивые результаты [Maiore et al, 1998]. Это позволяет предположить, что встраивание ДНК происходит только на определенной стадии клеточного цикла. Однако до настоящего времени не установлен механизм интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов.

Huguet и Esponda [1998] исследовали способность сперматозоидов поглощать линейную ДНК in vitro и in vivo. В опытах in vitro отмытые придатковые сперматозоиды инкубировали 2 часа с линейной ДНК. ДНК инъецировали в проксимальную область семенных канальцев, после чего через 6 часов извлекали сперматозоиды. Присутствие чужеродной ДНК было показано у 60-70% сперматозоидов. Сперматозоиды способны поглощать ДНК, аккумулировать ее в ядре. Секркты придатков и семенных канальцев не блокируют этот процесс.

Для повышения эффективности связывания ДНК со сперматозоидами используют различные методы: ДНК-липосомные комплексы [Bachiller et al 1991], инъекцию в семенники [Sato et al 1994], непосредственную инъекцию в семенные канальцы [Kim et al 1997] и придатки [Huguet и Esponda, 1998], инъекцию в семенные канальцы с последующей электропорацией [Yamazaki et al 1998], ко-инъекцию головок спермиев и ДНК в ооциты [Perry et al. 1999]. Также было показано, что экзогенная ДНК может быть эффективно доставлена в ооциты микроинъецированными сперматозоидами.

Большое внимание в последнее время привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников-сперматогониями [Brinster, Nagano. 1998]. Была продемонстрирована возможность переноса сперматогониев от одного самца другому как у животных одного вида (Avarbock, 1994; Brinster и Zimmermann. 1994), так и между двумя видами.

После пересадки половых клеток из семенников самца мыши в семенники другого самца, до 80% потомства происходило из сперматозоидов самца-донора. Была доказана возможность успешного протекания сперматогенеза после пересадки криоконсервированных клеток семенника и после их длительного консервирования.пересадке в семенники мышей клеток из семенников поздних стадий сперматогенеза половых клеток доноров выявлено не было /Dobnnski et al., 1999].

Успешное длительное культивирование половых клеток животных in uru делает возможным проведение трансформации сперматогониев экзогенной ДНК с последующей селекцией. Nagano с соавторами /2000] сообщили об успешном введении экзогенной ДНК в сперматогонии т vitro и in vivo посредством ретровирусной системы доставки. Экспрессия ретровирусной генной конструкции, включающей lacZ, наблюдалась в семенниках более 6 месяцев. Анализ показал, что по крайней мере 1 из 300 стволовых клеток семенников содержали трансген.