Схемы выделения целевого продукта в биотехнологическом производстве существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса (общая схема выделения на рис 1). Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскретируется) продуцентом в культуральную жидкость.

Предварительная обработка

сепарация

дезинтеграция

экстракция

экстракция, хроматограция, центрифугирование

хроматограция, центрифугирование,

электрофорез

Рисунок 1. Общая схема выделения БАС на заключительной стадии биотехнологического производства.

Одним из первых этапов на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы – сепарация. Иногда сепарации предшествует специальная обработка культуры – изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков. Существуют различные методы сепарации (флотация, центрафугирование, фильтрование), которые будут подробно рассмотрены в соответствующих разделах.

В данном разделе остановимся на методах гомогенизации (дезинтеграции) клеток или других образцов животного и растительного происхождения.

1. Методы гомогенизации

Физические методы.

1. Растирание с твердыми материалами.

Метод состоит в растирании клеток с песком или абразивным порошком в ступке при помощи пестика. Хорошие результаты дает продавливание клеток, смешанных с абразивными частицами, через пресс Хьюза. Модификацией этого метода является продавливание клеток при темепературе –25.

2. Разрушение клеток в жидких средах.

В этом случае разрушение происходит либо при вращении лопастей или поршня (блендеры), либо при поступательном движении вверх и вниз поршня или шаров (гомогенизаторы).

3. Разрушение клеток с помощью высокого давления.

Применяется в основном для разрушения микробных клеток. Для этой цели пользуются специальными прессами, например френч-прессом. Разрушение клеток происходит, когда клеточную суспензию под давлением продавливают через узкое отверстие.

4. Разрушение с помощью ультразвука.

5. Замораживание – оттаивание.

6. Декомпрессия.

Клеточную суспензию сжимают, а затем резко сбрасывают давление.

Химические методы.

1. Добавление органических растворителей.

Толуол, хлороформ, бензол

2. Осмотический шок.

Химико –ферментативные методы.

Добавление антибиотиков, переваривание клеточных стенок ферментами или сложными ферментативными препаратами, выделенными из улиток.

Далее перейдем к стадии получения целевого продукта. Здесь следует упомянуть три процесса, которые зачастую являются необходимыми при получении целевого БАС: консервация, стабилизация продукта, модификация продукта.

2. Консервация.

Обезвоживание:

Воздушная сушка при повышенной и нормальной температуре.

Сушка в кипящем слое.

Лиофилизация.

Замена воды на неводные растворители (Глицерин, хранение штаммов микроорганизмов на твердых подложках).

Замораживание, Добавка антибиотиков, Изменение рН, Изменение ионной силы

3. Стабилизация продукта.

Мероприятия, направленные на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем.

Обезвоживание и сушка.

Добавление органических растворителей.

Добавление неорганических ионов Со, Mg, Na (для пектиназы)

Формалин (0,2% р-р для глюкоамилазы)

Антибиотиков (низин для глюкоамилазы)

Использование биотехнологического процесса для стабилизации. Меланж, получаемый из яичных желтков, - ценный пищевой продукт. Порча меланжа может быть предотвращена, если из него удалить углеводы. С этой целью на меланже рекомендуется выращивать пропионовые бактерии, «ведающие» углеводы. Срок хранения увеличивается кроме того, пропионовые бактерии повышают питательную ценность меланжа, обогащая его органическими кислотами и витамином В12.

4. Модификация продукта.

Модификация необходима, когда получаем лишь «заготовку» целевого продукта.

Пенициллин G, образуемый Penicillin potatum, модифицируют с целью получения ампициллина и других полусинтетических пенициллинов.

Придание продукту соответствующей оптической ассиметрии, когда биообъект (скажем дрожжи) избирательно потребляет один из изомеров (например, L-аминокислоты), и в среде остается его оптический антипод.

Получение ряда ферментов, гормонов, когда, например, у бычьего инсулина «отстригают» аминокислотные остатки, после чего он становиться идентичным человеческому гормону.

Литература: 1. Б. Уильямс, К. Уилсон /Методы практической биохимии / Мир, 1975.

2. Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов /Биотехнология. Проблемы и перспективы/ книга 1, Высшая школа, 1987.

3. Ю.И. Детнерский /ПАХТ/, Т.2, стр272-274

Сепарация, осаждение, экстракция

1. Флотация.

Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Повышение эфективности отбора биомассы в виде концентрированной суспензии достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя. Флотацию широко используют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости.

2. Мембранные процессы.

Мембрану можно рассматривать как селективно-проницаемый барьер между двумя гомогенными фазами. Перенос через мембрану имеет место при наложении движущей силы, действующей на компоненты. В большинстве мембранных процессов движущей силой является разность давлений или концентраций (активностей) по обе стороны мембраны. Такие параметры, как давление, концентрация (активность) или даже температура, можно объединить в одном параметре – химическом потенциале . При постоянной температуре химический потенциал i-го компонента в смеси задается как

mi= mi0 + RT lnai + ViP

где mi0 химический потенциал 1 моля чистого вещества при давлении Р и температуре Т. Для чистых веществ активность равна единице, но для жидких смесей активность определяется выражением:

ai = Хi gi

где Хi – мольная доля и gi i –коэффициент активности.

Мембранные процессы можно классифицировать в соответствии с движущими силами процесса.

Таблица 1. Движущая сила в различных мембранных процессах.