В качестве вторичных эксплантов брались фрагменты побега длиной 7-10 мм. Оптимальным временем пассажа для Майкарагана волжского является 30-35 дней. В дальнейшем увеличения коэффициента размножения не происходило, и замедлялись темпы роста. Кроме того, у значительной части растений in vitro начинали подсыхать листья.

Из всех цитокининов наибольший коэффициент размножения наблюдался при использовании в качестве гормона 6-БАП. (табл. №5). Однако при этом происходили изменения в морфологии побегов: междоузлия побегов сократились, уменьшились размеры листьев, изменилась их форма. Кроме того, у половины побегов при концентрации 1.0 мг/л 6-БАП наблюдалась витрификация побегов (остекленение). При пересаживании растений-регенерантов на среды с меньшей концентрацией не все растения принимали нормальную морфологию.

Кинетин оказывал стимулирующее действие на регенерационные процессы в широком диапазоне концентраций (от 1.0 до 5.0 мг/л). Под его действием коэффициент размножения составил от 1,6 до 2,4. Растения-регенеранты были нормальной морфологии и за пассаж выросли на 1,9 – 2,3 см (табл. №6).

Полученные результаты продемонстрировали нецелесообразность использования в качестве цитокининов зеатина, так как индуцировать регенерацию побегов удалось не у всех эксплантов, стебли растений были очень тонкие, намного уменьшались размеры листьев.

Нецелесообразным оказалось использование гибберелловой кислоты на этапе вытягивания побегов перед укоренением. Линейный рост при концентрации 0,2 мг/л составил 0,3 см, а при 0,4 мг/л – 1,1 см (табл. №6) в то время как при использование кинетина линейный рост составил от 1,9 до 2,3 см. При выращивании побегов на среде с кинетином не требуется помещать их на среду с другим составом для вытягивания побегов, так как они и так уже с вытянутыми междоузлиями. Таким образом, нам удалось сократить процесс микроклонального размножения на один этап.

Общее количество растений-регенерантов можно повысить, если применить в сочетании два метода: культуру пазушных почек и выращивание растений из первичного каллуса. В качестве доноров экспланта при получении каллуса использовали корни, гипокотиль и семядольные листья. Изучали два варианта питательных сред, в составе которых присутствовали регуляторы роста 2,4-Д, ИУК и 6-БАП, а также ЩУК и повышенные концентрации сахарозы. Каллус индуцировали в условиях темноты. Наличие ауксина и цитокинина явилось обязательным условием для получения активно растущей каллусной культуры, так как на среде без экзогенных регуляторов роста процессы пролиферации не происходили. Частота индукции (возникновения) каллуса на всех изучаемых средах составила 100 %. Однако темпы пролиферации каллуса различались и зависели как от состава среды так и от экспланта. Так на семядольных листьях каллус вообще не возникал, на корнях наблюдалось возникновение небольших очагов. На гипокотиле образовывался хорошо растущий, морфогенный каллус. Побеги полученные в каллусной культуре переносили на питательную среду другого состава и на свет.

Выводы

1. Оптимальным стерилизующим средством на этапе введения в культуру следует считать «Лизоформин» в концентрации 3 %.При его использовании наблюдалась 100 % стерилизация семян.

2. Экспериментально доказано, что из всех использованных цитокининов лучшим индуктором побегообразования является кинетин. Он оказал стимулирующее действие на регенерационные процессы в широком диапазоне концентраций (от 1 мг/л до 5 мг/л).

3. Использование кинетина позволило сократить процесс клонального микроразмножения на один этап, так как не требовалось помещать растения перед укоренением на среду для вытягивания.

4. Наибольший коэффициент размножения наблюдался при использовании 6-БАП при концентрации 0,1 мг/л.

5. Эффективным оказалось сочетание метода культуры пазушных почек и выращивание растений из первичного каллуса. В этом случае регенеранты, полученные первым методом, выступают в качестве растений- доноров эксплантов, используемых для получения каллуса.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают реальную возможность использования методов биотехнологии для введения в культуру и сохранения вида. Считаем необходимым продолжить исследования по данной тематике.

Список литературы

1. Борисова А. Г. Род Calophaca Fisch. – Майкараган // Флора Юго-Востока европейской части СССР. Вып. 5. М.; Л.: Гос. изд-во с.-х. и колх. - коопер. лит-ры, 1931. С. 585.

2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Учебное пособие. М.: ФБК-Пресс, 1999. 160 с.

3. Васильева Л. И. Род Майкараган – Calophaca Fisch. Ex DC. // Флора европейской части СССР. Т. 6. Л.: Наука, 1987. С. 45-47.

4. Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохра нении генофонда растений.: монография/Барнаул: Издательство Алтайского университета,2004.с.93-131.

5. Володин В.,Филиппова В. Микроклональное размножение как способ сохранения редких и исчезающих видов растений//Бюллетень Главного Ботанического сада. М.: Наука,2004. с.125-127.

6. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - М.: Колос, 1979. 416с.

7. Красная книга Волгоградской области. Т.2. Волгоград: Волгоград, 2006. 236с.

8. Камелин Р.В. Биотехнологическое разнообразие и интродукция растений

//Растительные ресурсы, 1997, Т.33. Вып. 3. С.1 – 11.

9. Камелин Р. В. Майкараган волжский - Calophaca wolgarica (L. fil.) Fisch. ex DC. // Красная книга РСФСР (растения). М.: Росагропромиздат, 1988. С. 184-185.

10. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии.

Методические указания. М.: Издательство МСХА, 1996. 90 с.

11. Молканова О.И. Сохранение генофонда ценных растений с помощью культуры

тканей// Тезисы докл. VIII междунар. конф. – Саратов, 2003. – С.261.

12. Сагалаев В. А. К флоре степей правобережной части Волгоградской области // Бюл. Моск. об-ва исп. прир. Отд. биол. 1988. Ц93. вып. 3. С. 104-113.

13. Сагалаев В. А., Сурагина С. А., Игнатов С. М., Веденеев А. М., Баштаник Д. Ф. Перечень объектов растительного мира, рекомендуемых для занесения в Красную книгу Волгоградской области // Доклад о состоянии окружающей среды Волгоградской области в 2003 году. Волгоград, 2004г. С. 236-248.

14. Сагалаев В. А., Веденеев А. М., Сурагина С. А., Игнатов С. М., Баштаник Д. Ф. Аннотированный список редких и нуждающихся в охране видов растений и грибов Волгоградской области (материалы для Красной книги Волгоградской области) // Государственный доклад «О состоянии окружающей среды Волгоградской области в 2003 году». Волгоград, 2004г. С. 247-267.

15. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, С.В. Дегтярев, Г.М. Артамонова и др. М.: изд-во МСХА, 1995, 310 с.

16. Связева О. A. Calophaca wolgarica (L. fil.) DC. - Майкараган волжский // Ареалы деревьев и кустарников СССР. Т. 3. Л.: Наука, 1986. С. 26 [карта 11Д].

17. Шипчинский Н. В. Род Майкараган – Calophaca Fisch. // Деревья и кустарники СССР. Т.4. Москва – Ленинград, издательство Академии наук СССР, 1958. С. 197-198.