Стерилизация посуды. Для получения стерильной посуды используется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течение 2 часов при температуре 170оС в печи Пастера или в электросушильных шкафах (с нагревом до 200о С).

При отсутствии сушильных шкафов, стерилизация посуды может быть произведена на автоклаве или в духовом шкафу плиты (побурение бумаги показывает достаточность нагрева).

Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта, высушена и завернута в бумагу. Баллоны, склянки, трубки, пипетки заворачивают в бумагу поодиночке, и в этой бумаге они сохраняются до момента использования. Чашки Петри могут быть завернуты по 2—3 вместе. Пипетки перед стерилизацией затыкают с широкого конца ватой и заворачивают (закатывают) в узкие, длинные ленты бумаги, начиная с оттянутого кончика.

Пробирки должны быть закрыты ватными пробками. Для заворачивания посуды при стерилизации и сушильном шкафу лучше пользоваться тонкой бумагой (лимонной или папиросной), при стерилизации в автоклаве — газетной (которая не размокает). Нельзя стерилизовать посуду, закрытую притертыми пробками.

Для получения стерильных игл, петель при производстве посевов, взятии материала из культур для приготовления мазков пользуются стерилизацией прокаливанием на пламени. При этом па пламени (спиртовки, газовой горелки) подвергают кратковременному обжиганию горлышки пробирок, колб, пробки и т. д.

Стерилизация автоклавированием применяется, главным образом, для стерилизации питательных сред. Этот способ основан на прогревании насыщенным паром при давлении выше атмосферного, т. е., при температуре выше 100оС и осуществляется в специальных аппаратах- автоклавах.

Совместное действие высоких температур и пара обеспечивает надежность стерилизации - гибель вегетативных клеток и спор микроорганизмов. Автоклавирование проводят при различных режимах, при дополнительном давлении 50,100,200 кПа (Градова и др., 2001).

Приготовление питательных сред. При составлении питательных сред необходимо учитывать потребность микроорганизмов в элементах питания. По составу среды подразделяют на две группы: естественные и синтетические.

С.Н. Виноградским в практику микробиологии введены элективные (избирательные среды для определенных групп микроорганизмов, обеспечивающие преимущественное развитие одного вида или группы родственных микроорганизмов и менее пригодные или совсем не пригодные для развития других.

Зная физиологические особенности соответствующей группы микробов, можно подобрать такие условия культивирования, при которых будут развиваться лишь представители этой группы. Применяют питательные среды различной консистенции: плотные, жидкие, полужидкие (Теппер и др., 1987).

Для выделения маслянокислых бактерий используется среда Виноградского (г/л):KH2PO4- 1,0 г.; MgSO4 * 7H2O –0,5 г.; NaCl – 0,5 г.; MnSO4- 0,01 г.; Fe2 (SO4)3*9H2O- 0,01 г.; CaCO3- 20г.; KNO3- 4г.; дистиллированная вода - 1л.

При посеве исследуемой почвы 1 г. растертой стерильным пестиком в ступке почву помещали в пробирку с 10 г. стерильной воды. Затем производили ряд последовательных разведений; 10-1 - 10-7 разведения разливали по 1 мл в большие стерильные пробирки методом глубинного посева. В полученную культуральную жидкость заливали жидкую среду Виноградского до ¾ объема. Пробирки со средами помещают в водяную баню при 80оС на 10-15 мин., так как при кипячении в культуральной жидкости создаются анаэробные условия. Посевы помещают в термостат при температуре 30-35 ос. Инкубация производится в течение 2-3 дней.

При исследовании культуральных признаков обращают внимание на следующие признаки:

1. Изменение цвета среды (изначально среда прозрачная). Цвет меняется от желтого до коричневого.

2. Образование осадка

3. Появление мути.

4. Образование пленки.

Культуру отбирают из середины столбика жидкости и эту каплю помещают на середину предметного стекла, накрывают покровным стеклом и к краю предметного стекла подносят пипетку с раствором Люголя. К другому краю - фильтровальную бумагу, которая засасывает раствор под покровное стекло.

При микроскопировании препарата хорошо видны клетки клостридий с потемневшим содержанием, так как перед спорообразованием в клетках накапливается много гранулезы, которая при взаимодействии с Люголем дает темное окрашивание (Теппер и др., 1987).

Микроскопирование маслянокислых бактерий. Питательную среду из колбы Вюрца или пробирки берут пипеткой, закрыв указательным пальцем верхний конец и погрузив ее в средний слой сброженной жидкости. Слегка приподняв палец, набирают в пипетку жидкость, снова зажимают пальцем верхний конец пипетки и, вынув ее из колбы, наносят каплю на предметное стекло. К накопительной культуре добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом, на которое помещают каплю кедрового масла. При микроскопировании препарата обнаруживаются клетки, в которых можно заметить овальные тельца, сильнопреломляющие свет (споры). В тех местах клетки, где содержится гранулеза, возникает сине- фиолетовое окрашивание. Зарисовывают только окрашенные клетки, явно относящиеся к группе маслянокислых бактерий.

При постановке накопительной культуры целлюлозоразлагающих аэробных бактерий используют среду Гетченсона. Слой среды Гетченсона-1 см. Вносят 0,5 -1 г. почвы и на кончике шпателя – мел. Колбу закрывают ватной пробкой, помещают в термостат на 10-14 суток. Бумага становится ослизненной и распадается, конус оседает на дно.

Для получения целлюлозоразрушающих аэробных бактерий используют среду (г/л): КН2РО4-0,1; NaCl -0,1; CaCl2-0,1; TeCL3-0,1; MgSO4 *7Н2О- 0,3; NaNO3-2,5; агар-агар -2%.

Среду разливают в чашки Петри и на поверхность накладывают фильтровальную бумагу, нарезанную по размеру чашки Петри и предварительно тоже простерилизованную.

Стеклянной палочкой с оттянутым концом на поверхность фильтра раскладывают параллельными рядами комочки почвы на расстоянии 1см. (по трафарету). Засеяны чашки Петри помещают в эксикатор над водой и ставят в термостат при 25-30оС.

Через 10-14 суток вокруг комочков почвы развиваются комочки целлюлозоразлагающих микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В местах образования колоний фильтровальная бумага разлагается, ослизняется, становится прозрачной. По морфологии можно дифференцировать колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий. Принимая общее число высеянных комочков почвы за 100%, можно подсчитать в процентах число комочков почвы, давших колонии целлюлозоразлагающих микроорганизмов. Из зон разрушения клетчатки готовят препарат « раздавленная капля» и описывают выделенные различные целлюлозоразрушающие микроорганизмы.

Микроскопирование целлюлозоразлагающих бактерий. Извлекают пинцетом со дна колбы кусочек разлагающейся бумаги и размазывают на предметном стекле без добавления воды. Мазок сушат обычным способом, фиксируют на пламени горелки и окрашивают фуксином.

Для накопительной культуры анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий используют среду, предложенную Имшенецким: мясопептонный бульон - 500 мл, СаСО3 – 2 г, фильтровальная бумага-15 г, водопроводная вода- 0,5 л.