3.3. Определение концентрации белковых препаратов

Концентрацию белков определяли спектрофотометрически с помощью спектрофотометра SPECOD UV VIS, используя следующие значения коэффициентов экстинции (Е2801 мг/мл): 0.543 для доколоночного миозина (Kielley & Harrington, 1960); 0.52 для колоночного миозина (Godfrey & Harrington, 1970); 1.08 для актина (Rees & Young, 1967); 1.37 для тайтина (Trinick et al., 1984); 1.09 для Х-белка, С-белка и Н-белка (Starr & Offer, 1982).

3.4. Проверка чистоты белковых препаратов

Чистоту выделенных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970).

Чистоту тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза по методу (Fritz et al., 1989) с модификациями. Согласно нашей методике, разделяющий гель содержал 7% полиакриламида вместо 15%, а также 0.75 М трис-HCl буфер, pH 8.8, 0.1% ДСН, 10% глицерина, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Кроме этого, вместо концентрирующего геля с содержанием полиакриламида 5% согласно (Fritz et al., 1989) применялся концентрирующий гель по методу (Laemmli et al., 1970), содержащий 2.6–2.8% полиакриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1). Эти модификации способствовали лучшему фокусированию белковых полос в геле. Концентрирующий гель также содержал 0.125 М трис-HCl буфер, pH 6.8, 0.1% ДСН, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Модифицированный нами метод ДСН-гель-электрофореза позволил проводить электрофоретическое разделение белков с молекулярным весом от 3 МДа до 100 кДа, что дало возможность исследовать совместное поведение тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка.

Электродный буфер при проведении электрофореза содержал 0.192 М глицина, 0.025 М трис и 0.1% ДСН, рН 8.3. Электрофорез проводили при токе 3–5 мА первые 30–60 минут, после этого поднимали напряжение до 12–15 мА. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 10% этанола и 10% уксусной кислоты, в течение 20–30 минут. Затем гели окрашивали в течение 30–40 минут в растворе, содержащем 0.1% кумасси G-250 и R-250 (смешанных в пропорции 1:1), 45% этанола и 10% уксусной кислоты. Отмывка окрашенных гелей проводилась в 7% уксусной кислоте при постоянном перемешивании на качалке в течение 40–50 мин.

3.5. Условия формирования амилоидных фибрилл

Амилоиды формировали диализом растворов белков в течение 20 часов при 4-37°С против растворов, содержащих: 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0; 0.15 М глицин-KOH, рН 7.5; 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, pH 7.0; 50 мM NaCl, 10 мM Hepes, pH 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ имидазола, pH 7.0; 50 мM MgCl2, 10 мM имидазола, pH 7.0.

Для исследования скорости амилоидообразования раствор Х-белка диализовали против буфера, содержащего 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4˚С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для электронно-микроскопических и спектральных исследований. Для экспериментов по исследованию цитотоксичности амилоидных образований Х-белок также инкубировали в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4˚С.

3.6. Микроскопические исследования

3.6.1 Электронная микроскопия

Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрациями 0.1 мг/мл. Каплю раствора или суспензии белка наносили на медные сетки, покрытые коллодиевой пленкой (2% коллодий в амилацетате фирмы SPI-CHEM, USA), укрепленной углеродом. После удаления избытка суспензии полоской фильтровальной бумаги образцы окрашивали 2% водным раствором уранилацетата.

Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе JEM-100В при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 30000х. Увеличение микроскопа было тестировано по паракристаллам парамиозина с периодичностью 14.5 нм.

3.6.2. Поляризационная и флуоресцентная микроскопия

Исследуемые образцы, наносились на предметные стекла и высушивались на воздухе. Образовавшиеся белковые пленки окрашивались 1% водным раствором Конго красного (фирма SIGMA, USA) и затем исследовались на поляризационном микроскопе МКУ-1. Образцы также окрашивались 1% водным раствором тиофлавина Т (фирма SIGMA, USA) и исследовались с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И 3.

3.7. Спектральные методы

3.7.1. Метод кругового дихроизма

Исследование вторичной структуры белка проводили методом кругового дихроизма. Спектры кругового дихроизма исследуемых белков, до и после образования ими фибрилл, регистрировали на спектрополяриметре Jasco J-600, используя кварцевые кюветы с оптической длиной 0.1 см. Спектры КД были измерены в области 200–250 нм. Обсчет спектров КД в далекой ультрафиолетовой области производился с использованием программы CONTINLL (http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/).

3.7.2. Метод флуоресцентного анализа

Исследование амилоидной природы фибрилл, а также исследование скорости амилоидообразования было проведено с использованием классического флуоресцентного красителя амилоидных структур тиофлавина Т (ТТ). Измерения флуоресценции проводили в растворе красителя (250 мкл) и суспензии фибрилл (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Интенсивность флуоресценции раствора регистрировали с помощью спектрофлуориметра PERKIN-ELMER - 44B при длине волны 488 нм и при длине волны возбуждения 420 нм. Ширина щели при возбуждении 5 нм, а при регистрации 10 нм. Из полученных значений интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в буфере в присутствии белка вычитали значения интенсивности флуоресценции ТТ в буфере в отсутствие белка, получая интенсивность флуоресценции ТТ, связанного с белком.

3.7.3. Спектрофотометрический метод

Для подтверждения амилоидной природы фибрилл был также использован специфический краситель Конго красный (КК). Суспензию фибрилл (250 мкл) добавляли к раствору КК (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Спектры поглощения КК в отсутствие и в присутствии белка регистрировали при 450–650 нм с помощью спектрофотометра SPECORD M 40.

III. Результаты и обсуждение

Глава 4. образование амилоидных фибрилл белками семейства тайтина

4.1. Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств молекул тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка скелетных мышц кролика

Изучение амилоидогенеза разных белков in vitro проводят в условиях, которые часто не совместимы с условиями in vivo. Для образования амилоидных фибрилл белками семейства тайтина мы использовали условия, близкие к физиологическим. С помощью электронной микроскопии было показано, что исследуемые белки способны формировать разные амилоидные агрегаты, как и другие известные амилоидогенные белки (Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000; O'Nuallain et al., 2004; Uversky & Fink, 2004; см. рис. 5, 6).