2.5 Принципы составления питательных сред для грибов. Основные принципы композиции сред

При составлении питательных сред для грибов обычно пользуются результатами предварительных исследований по выяснению значения для роста и развития изучаемого объекта концентрации отдельных компонентов (источников углерода, азота, зольных веществ и витаминов).

Основными правилами, которых придерживаются при составлении сред, способствующих росту грибов, являются следующие:

1) целесообразно применять отдельные источники углерода и азота;

2) концентрация вещества, служащего источником азотного питания, должна сильно уступать концентрации вещества – источника углерода (примерно в 10 – 15 раз).

Хотя среды натурального происхождения более благоприятны для роста большинства грибов, однако при физиологических экспериментах по изучению развития и обмена у грибов использовать их нежелательно, так как их состав непостоянен. Для этих экспериментов обычно используются синтетические среды. Одной из первых синтетических сред для грибов (культур видов аспергиллов и пенициллов) была среда Роллена следующего состава (г/л):

сахароза – 72 (около 5 %);

винная кислота – 4,0 (для подкисления среды);

фосфорнокислый аммоний – 4,0;

углекислый калий – 0,6;

сернокислый аммоний – 0,25;

сернокислый цинк – 0,07;

сернокислое железо – 0,07;

кремнекислый калий – 0,07;

дистиллированная вода – 1,5 л.

Более простой состав имеет среда Чапека (г/л):

сахароза – 30,0;

NaNO3 – 2,0;

MgSO4 – 0,5;

FeSO4 – 0,01;

KH2PO4 – 1,0;

KCl – 0,5;

дистиллированная вода – 1,0 л.

Для многих грибов указанные здесь среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов – дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов – паразитов растений – ткани растения – хозяина; выращивание грибов – копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).

2.6 Приготовление питательных сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 150 мл, рассчитанной на 10 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм и 120 ○С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.

2.7 Определение способности плесневых грибов использовать различные источники углерода

2.7.1 Определение радиальной скорости роста на твердой среде

Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.

В качестве единственного источника углерода использовали сахара (лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, сорбит), крахмал, целлюлоза, природные целлюлозные материалы (растительный опад, камыш, опилки, кора, сено). Источники углерода добавляли в среду в мелко нарезанном виде. Все источники углерода добавлялись в среды количеством 45 г/л.

В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека без сахарозы с различными источниками углерода. Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования – 24 ○С. Параллельно производят посев на среду Чапека с сахарозой (контроль 1) и без сахарозы (контроль 2). Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.

Определение радиальной скорости роста грибов проводили на плотной питательной среде за определенный промежуток времени. После 48 часов инкубации при 24 ○С измеряли диаметр выросших на чашках колоний при помощи линейки. Эту операцию повторяют через каждые двое суток в течение двух недель.

За диаметр отдельной колонии в данный момент времени принимают среднее арифметическое измерение. Вычисление радиальной скорости проводят по формуле:

Kr = (r – ro) / (t – to),

где k – радиальная скорость роста;

ro – радиус колоний в начальной момент времени to;

r – радиус колоний в момент времени t (Паников, 1991).

2.7.2 Изучение прорастания спор в капле субстрата

На основании метода проращивания грибных зачатков во влажной камере, можно определять способность грибов к ассимиляции различных субстратов. На предметные стекла с лункой наносятся споровая суспензия в гидролизате (камыша, опилок, сена, растительного опада, коры), сверху накрывали покровными стеклами, и помещали во влажную камеру. Предварительно гидролизаты готовили: мелко измельченные растительные материалы заливали дистиллированной водой количеством 10 г на 1 л, кипятили в течение 15 минут для наибольшего выхода воднорастворимых органических веществ из растительных субстратов, затем подвергали стерилизации при 120 ○С в автоклаве. Споровую суспензию готовили следующим образом: микроскопические грибы 10 дней выращивали на среде Чапека в пробирках (скошенный агар), после производили смыв 10 мл гидролизата. Для удаления обрывков мицелия суспензию фильтровали через 2-слойную стерильную марлю. Чистоту и плотность суспензии проверяют при микроскопировании в камере Горяева. Для основных опытов плотность споровой суспензии составляет 106 спор в мл. Прорастание спор начинают учитывать через 24 часа. Прорастание спор рассчитывается как отношение числа проросших спор к общему числу просмотренных. Наблюдение проводят на 1, 2, 3, 7, 15-е сутки. Стекла микроскопировали, учитывая прорастание спор (%), длину проростков (в мкм) (Кураков, 2001).

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ РОСТА МИКРОМИЦЕТОВ НА РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТАХ

Объектами исследования явились 10 штаммов коллекционных микроскоскопических грибов родов Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus, а также штаммы родов Alternaria sp., Penicillium sp., Cladosporium sp., Trichoderma sp., Verticillium sp. В качестве источников углерода использовали сахара (лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, сорбит), крахмал, целлюлоза, природные целлюлозные материалы (листья, камыш, опилки, кора, сено).