Интересные данные о влиянии внутрибрюшинного введения самцам крыс физиологического раствора на активность ферментов обмена нейропептидов приводятся в работе Вернигоры и соавт. [38]. Ими обнаружено повышение активности КПН в гипофизе и стриатуме, АПФ в гипофизе и сыворотке крови, КПN в сыворотке. Эти ферменты участвуют в обмене целого ряда НП, поэтому внутрибрюшинное введение физраствора может приводить к значительным изменениям в функционировании пептидэргических систем. Причем эти изменения затрагивают стресс-систему, опиоидэргическую и ангиотензин-брадикининовую систему. Поэтому при проведении острых экспериментов необходимо рассматривать все наблюдаемые явления с учетом изменений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией [38]. В ряде работ указывается, что, по-видимому, КПН, КПN и АПФ вовлекаются в реализацию стресс-протективного действия этанола [26, 40].

Таким образом, этанол вызывает изменение активности ряда протеолитических ферментов. Это, в свою очередь, ведет к изменению уровня многих регуляторных пептидов, что можно рассматривать как один из патогенетических факторов алкоголизма.

1.4. Карбоксипептидаза H (КФ 3.4.17.10)

КПH (КПE, энкефалинконвертаза) впервые выделена и охарактеризована Fricker и Snyder из хромаффинных гранул надпочечников быка, как фермент, образующий энкефалины из их предшественников [152]. Позднее фермент был выделен и очищен из мозга [34, 153, 154], гипофиза [153, 154], островков Лангерганса поджелудочной железы [122, 133, 161, 198]. Фермент, выделенный из разных тканей разных видов животных, имеет очень близкие физико-химические и каталитические свойства.

КПH является одноцепочечным гликопротеином и существует как в растворимой, так и в связанной с мембранами формах [34, 122, 197]. Существуют две формы мембраносвязанной КПH, отличающиеся по прочности связывания с мембранами. Одна из этих форм экстрагируется из мембран при pH 5,6 1 M раствором NaCl, вторая – только при совместном воздействии 1 M NaCl и 1% Тритона X-100 [147, 258].

Фермент синтезируется в виде неактивного зимогена с Mr 75000 [209], который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул [140, 161]. Сначала образуется неактивная форма с Mr 65000 [168, 169], которая превращается в активные формы с Mr 52000 - 53000 и 55000 - 57000 [140, 161, 220]. Отличия в Mr этих форм не связаны с различиями в степени гликозилирования [161, 220, 221]. Форма с Mr 55000 - 57000 отличается от формы с Mr 52000 - 53000 наличием N-концевого сигнального пептида [220]. Обе формы существуют и в растворимом, и в связанном с мембранами виде [161, 140]. Активность растворимой формы фермента в расчёте на молекулу фермента выше, чем мембраносвязанной [143, 147]. Соотношение между растворимой и мембраносвязанной формами изменяется по мере созревания секреторных везикул [171]. За связывание фермента с мембранами отвечает C-концевая амфифильная последовательность, которая присутствует только у мембраносвязанной формы [147]. Она состоит из 21 остатка чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот. В аминокислотной последовательности КПH обнаружен также Ca2+-связывающий участок [213], но ионы Ca2+ влияют не на активность, а на стабильность, агрегацию и способность к связыванию с мембранами [255].

КПН проявляет максимальную активность при рН 5,5-6,0, что соответствует рН внутри секреторных везикул и является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится ион Zn2+ [149, 153]. Данный фермент сильно (примерно в 5-10 раз) активируется ионами Со2+, в меньшей степени (в 2-3 раза) – ионами Ni2+, ингибируется ионами Сd2+ и Cu2+, хелатирующими агентами: ЭДТА, о-фенантролином, при применении которых активность фермента восстанавливается добавлением ионов Zn2+. Фермент также ингибируется реагентами на сульфгидрильные группы: ПХМФС, ПХМБ, N-этилмалеимидом и органическими кислотами, содержащими амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Кi 8,8 и 7,5 нМ соответственно.

ФМСФ, 2-меркаптоэтанол, а также ионы Мg2+ и Mn2+ не влияют на активность КПН [149, 152, 153, 167, 258].

КПH отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца синтетических и природных пептидов. Скорость отщепления остатков аргинина в несколько раз больше, чем остатков лизина. Остатки гистидина отщепляются с очень маленькой скоростью, по сравнению с остатками лизина. Остатки ароматических аминокислот не отщепляются. Скорость расщепления субстратов зависит от предшествующего аминокислотного остатка. Скорость расщепления дансил-фен-ала-арг на порядок выше, чем скорость расщепления дансил-фен-гли-арг, дансил-фен-лей-арг и дансил-фен-иле-арг [167, 172, 234, 254].

Локализация фермента в целом соответствует распределению биологически активных пептидов и их предшественников [50, 144, 145]. Наиболее высокая активность КПH обнаружена в аденогипофизе, хромаффинных гранулах надпочечников [152, 153, 154] и островках Лангерганса поджелудочной железы [122, 161]. Более низкая (примерно на порядок) активность фермента обнаруживается в задней доле гипофиза [172, 177], гипоталамусе, стриатуме, гиппокампе, среднем мозге, коре больших полушарий [89]. Наиболее низкая активность КПH обнаружена в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках. Установлено, что КПH ассоциирована со структурными элементами ЭПР, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [144]. Фермент обнаружен в секреторных везикулах, содержащих энкефалины [196], атриальный натрийуретический фактор [197], глюкагон [161, 218], инсулин [122, 133], АКТГ [134, 201], пролактин [150], вещество P [111], вазопрессин и окситоцин [214, 234] и другие регуляторные пептиды. Различные ингибиторы и активаторы секреции координировано регулируют выделение КПH и энкефалинов [151, 170], АКТГ [182, 183, 201], пролактина [150], вазопрессина [103, 200] и инсулина [160].

Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на культуры клеток, нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПН свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, b-эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий гормон, вещество Р и др.

Показано, что КПН вовлекается в определение агрессивности [52], предрасположенности к потреблению этанола[56], в развитие физической зависимости от этанола[14, 49, 52, 55], в ответ на различные стрессирующие воздействия [30, 33, 48, 52], введение стероидных гормонов in vivo [39], имеются данные о наличии половых различий в активности фермента [78].

1.5. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

В 1995 г. Вернигора и соавт. обнаружили в растворимой фракции серого вещества головного мозга кошки основную КП, активность которой полностью подавляется ФМСФ [42].