е. Регуляция экспрессии генов на разных этапах образования РНК и белка

Клетки про- и эукариот обладают способностью к дифференциальной регуляции экспрессии генов. Так, при определенных условиях многие гены вообще не экспрессируются, а степень экспрессии других различается на несколько порядков. Изменение условий может привести к активации «молчавших» ранее генов и репрессии активно работавших. Подобная способность позволяет клеткам приспособить свои фенотипы к самым разнообразным условиям окружающей среды и физиологическим воздействиям. Дифференцированная экспрессия одного генома у многоклеточных организмов обусловливает развитие огромного множества типов клеток, имеющих специфические функции, из одной или нескольких зародышевых клеток.

Экспрессия генов, как правило, регулируется на уровне образования РНК. Обычно регулируемым этапом является инициация транскрипции, при этом регуляция осуществляется либо с помощью репрессорных белков, предотвращающих транскрипцию, либо с помощью активаторных, необходимых для ее начала. В первом случае транскрипция начинается только после того, как инактивируется репрессорный белок. Во втором ген транскрибируется лишь тогда, когда белок-активатор находится в соответствующем функциональном состоянии. В регуляции транскрипции генов участвуют не только репрессорные и активаторные белки. В некоторых случаях сами белки – продукты генной экспрессии – оказываются регуляторами транскрипции собственных генов. Эффективность транскрипции зависит также от конформационного состояния ДНК или РНК. Кроме того, регуляция синтеза РНК может осуществляться путем контроля скорости ее элонгации или с помощью «стоп-сигнала» в транскрибируемой последовательности, который может остановить транскрипцию гена. Модификация и / или процессинг, которые могут предшествовать образованию зрелой функциональной РНК, также регулируются.

Экспрессия генов может регулироваться и на уровне трансляции мРНК с образованием белков. И в этом случае специфическая регуляция, как правило, осуществляется на начальном этапе декодирования. Однако контроль может осуществляться и на разных этапах сборки полипептидной цепи. Более того, синтез тех белков, которые претерпевают посттрансляционные модификации или транспортируются к местам своего назначения внутри клетки, может регулироваться на каждом из этих этапов.

Позднее, когда мы проанализируем эти процессы подробнее, мы увидим, что механизмы регуляции экспрессии генов весьма разнообразны, многочисленны и очень сложны. И хотя многим из них присущи общие черты, тонкие механизмы регуляции всегда уникальны для данного гена, определенного физиологического состояния организма и условий окружающей среды. Анализ регуляторных механизмов бактериальных систем позволил выявить широкий спектр способов регуляции и координации экспрессии генов. Однако исследование механизма контроля экспрессии генов в клетках эукариот только начинается, а процессы, ответственные за дифференцировку многоклеточных организмов, пока остаются невыясненными.

2. Транскрипция: передача информации о нуклеотидной последовательности ДНК на уровень РНК

В этом и следующем разделах мы рассмотрим некоторые аспекты переноса информации о нуклеотидной последовательности ДНК на уровень РНК – процесса, ответственного за синтез всех типов клеточных РНК как у про-, так и у эукариот. Подавляющее число пионерских работ, в которых изучалась транскрипция, – природа соответствующих реакций и их субстраты, ферментативный аппарат, сигнальные нуклеотидные последовательности, определяющие, какие области ДНК должны транскрибироваться, некоторые способы процессинга, превращающего первичные транскрипты в зрелые молекулы РНК, – было выполнено на прокариотических системах. Параллельное проведение генетических и биохимических экспериментов позволило исследовать ферменты, участвующие в транскрипции, и механизм самого этого процесса. Предпринимаемые в то же время усилия по изучению транскрипционного и регуляторного аппаратов у эукариот были сильно затруднены и гораздо менее успешны главным образом из-за того, что компоненты их транскрипционного аппарата – ДНК в форме хроматина и РНК-полимеразы – были слабо охарактеризованы. Кроме того, была неизвестна природа транскрипционных единиц, а применение генетических подходов для их определения было невозможно.

Ситуация резко изменилась с появлением методов молекулярного клонирования. Сейчас многие гены, составляющие различные типы транскрипционных единиц, выделены, секвенированы и даже соответствующим образом модифицированы с целью исследования их функций. Более того, использование некоторых современных подходов позволило по-новому посмотреть на транскрипционный аппарат самых разных организмов – от дрожжей до человека. Имеются в виду методы введения ДНК в культуры клеток млекопитающих и даже в клетки целого организма животных, применяемые наряду с традиционными методами исследования очищенных транскрипционных систем in vitro. Одновременно был достигнут прогресс в установлении структуры хроматина и свойств эукариотических РНК-полимераз. Подробные данные о структуре генов, механизме транскрипции и непосредственно связанных с ней посттранскрипционных событиях, происходящих при синтезе РНК у эукариот.

а. Синтез РНК на ДНК-матрице

Двухцепочечная молекула ДНК – это физиологическая матрица для синтеза всех клеточных РНК. Даже если геном, как у некоторых вирусов, представлен одноцепочечной ДНК, последняя перед транскрипцией обязательно переходит в двухцепо-чечную репликативную форму. Транскрибирована может быть любая из двух цепей геномной ДНК, однако матрицей при транскрипции отдельного гена обычно служит только какая-то одна из них. Впрочем, в некоторых случаях все мРНК транскрибируются с одной и той же цепи. Очень редко транскрипция идет на обеих цепях в одном и том же месте, так что образующиеся цепи РНК оказываются комплементарны друг другу; возможно, подобный способ транскрипции имеет особое регуляторное значение.

Нуклеотидными предшественниками для синтеза РНК являются четыре рибонуклеозид-5'-трифосфата: ATP, GTP, UTP и СТР. Многие РНК содержат модифицированные нуклеотиды, но изменения в основаниях и рибозных остатках происходят после полимеризации, т.е. посттранскрипционно. Тем не менее, РНК-полимеразы могут использовать рибонуклеозид-5'-трифосфаты, отличные от указанных четырех, при условии, что модифицированные основания обладают способностью к спариванию, сравнимой с таковой для аденина, гуанина, цитозина и урацила.

РНК-полимеразы катализируют реакцию присоединения 3'-ОН-группы нуклеотида, находящегося на растущем конце цепи, к а-фосфату следующего рибонуклеозид-5'-трифосфата. Многократное повторение этой реакции приводит к постепенному удлинению цепи РНК. Образование каждой новой фосфодиэфирной связи сопровождается высвобождением неорганического пирофосфата; быстрый гидролиз пирофосфата до неорганического фосфата in vivo делает реакцию образования фосфодиэфирной связи энергетически выгодной.

Транскрипция аналогична репликации в том смысле, что для ее осуществления также нужна ДНК-матрица. Порядок присоединения нуклеотидов определяется комплементарным спариванием оснований. Чтобы могло происходить комплементарное спаривание каждого следующего нуклеозидтрифосфата с матричным транскрибируемым основанием, спираль ДНК во время транскрипции должна раскручиваться с помощью ДНК-полимеразы. Растущая цепь РНК остается связанной с ферментом и спаренной своим растущим концом с участком матричной цепи длиной 20–30 нуклеотидов; остальная часть образовавшейся цепи не связана ни с ферментом, ни с ДНК. По мере продолжения транскрипции временно разошедшиеся цепи ДНК воссоединяются и восстанавливается исходная дуплексная структура. Таким образом, транскрипция – процесс консервативный, в котором сохраняется двойная спираль ДНК, а синтезированная цепь РНК отделяется. В противоположность этому репликация ДНК полуконсервативна, поскольку обе цепи исходного дуплекса распределяются по двум дочерним спиралям. Другое существенное различие между репликацией и транскрипцией ДНК состоит в том, что репликация не может начаться без затравки – праймера, а инициация синтеза РНК с помощью РНК-полимеразы происходит de novo, начинаясь с рибонуклеозидтрифосфата, соответствующего первому нуклеотиду в цепи РНК.