АПФ является физиологическим регулятором концентрации в плазме пептида AcSDKP (N-AcSer-Asp-Lys-Pro), влияющего на пролиферацию гемопоэтических и других клеток.

Фермент участвует в регуляции артериального давления. Кроме того, он вовлечен в реализацию таких функций как репродуктивные процессы, защитные и иммунные реакции организма. Участие фермента в том или ином процессе определяется как его локализацией, так и особенностью действия на регуляторные пептиды [20,56]. Являясь фактором, связывающим ККС и РААС – систем, вовлеченных в регуляцию большинства функций организма, реагирует на изменения, возникающие при патологических процессах. В связи с этим представляет интерес изучение активности фермента у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии.

1.2.3.2 Карбоксипептидаза N. Карбоксипептидаза N (КФ 3.4.12.7. КП N, аргинин-карбоксипептидаза, кининаза I) обнаружена Erdos и соавт. в плазме крови человека в 1962 году. Названа так потому, что по свойствам и специфичности он близок к панкреатической карбоксипептидазе B, но отличается от нее тем, что не имеет неактивного предшественника. Относится к ферментам вневизикулярной локализации – внеклеточной жидкости и внешней поверхности цитоплазматических мембран. Фермент локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов, слизистой оболочке носа, моче [13].

Фермент имеет Mr 280 кДа и состоит из четырёх субъединиц трёх типов: двух с Mr 88 кДа и по одной с Mr 55 кДа и 48 кДа. Субъединицы с Mr 88 кДа гликозилированы (на долю углеводов приходится 29% массы), не обладают ферментативной активностью и, по-видимому, стабилизируют фермент в плазме крови [61]. Субъединицы с Mr 48 кДа и 55 кДа обладают ферментативной активностью и не содержат в своём составе углеводных остатков [13,58].

КП N относится к металлокарбоксипептидазам. Активный центр фермента имеет форму кармана, в полости которого находится ион Zn2+. В цельной сыворотке крови человека фермент активируется ионами Co2+ и в меньшей степени Ni2+, инактивируется ионами тяжелых металлов, бензоилом–L-аргинином, и хелатными соединениями. Тормозящее действие ингибиторов КП N проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo. При внутривенном введении ингибитора (2-меркаптоэтанол, ЭДТА) усиливалось гипотензивное действие брадикинина. Каталитическая активность фермента оптимальна при pH 7,0 – 7,8, и зависит от природы буферной смеси. В фосфатном буфере максимум активности находится при pH 7,5; в зоне pH 7,0 – 6,0 наблюдается резкое падение активности; в трис-буфере pH – оптимум составляет 7,0. Фермент чувствителен к кислой среде. При pH среды 2,0 – 3,0 он инактивируется необратимо, а при pH 6,5 – 5,0 – обратимо. Трапезникова С.С. и Пасхина Т.С. провели работу по изучению свойств карбоксипептидазы N из сыворотки крови человека, очищенного в 273 раза. Полученные препараты, по данным ультрацентрифугирования, состояли из двух компонентов с константой седиментации 5,3S и 6,5S. Отмечена четко выраженная зависимость фермента от температуры: максимальная активность проявляется при 37°С, при 30°С она снижается наполовину. Лиофилизированные препараты сохраняют свою активность в течение 6 месяцев [4,13].

Помимо способности отщеплять С-концевой аргинин в брадикинине (истинная кининазная активность) и Met5-энкефалин-Arg6, лизин в Met5-энкефалина-Lys6, карбоксипептидаза N гидролизует более простые синтетические субстраты: гиппурил-L-аргинин, гиппурил–орнитин (пептидазная активность), а также расщепляет эфиры гиппурил-L-аргининовой кислоты [27]. При этом скорость расщепления субстратов, содержащих C-концевые остатки лизина в 5-6 раз выше, чем соответствующих пептидов с C-концевым аргинином. Скорость расщепления гиппурил-аргининовой кислоты в несколько раз выше, чем гиппурил-аргинина. Эстеразная активность фермента угнетается ионами тяжелых металлов, в особенности Cd2+ , а также аргининовой кислотой и ЭДТА [13].

Биологическая роль КП N во многом остаётся неясной. Инактивируя брадикинин, она способна вовлекаться в регуляцию артериального давления и тонуса кровеносных сосудов. Однако реальный вклад фермента в инактивацию брадикинина in vivo не превышает 10-12%. Некоторые авторы предполагают, что КПN может играть роль модулятора действия брадикинина [57,62].

Активность КПN изменяется при воспалительных и аллергических реакциях, так как подкисление реакции среды в тканях будет способствовать накоплению кининов из-за торможения кининазной активности фермента. Поскольку фермент расщепляет пептиды, участвующие в развитии воспалительных реакций (брадикинин и анафилотоксины), и его активность в крови снижается при введении рекомбинантного интерлейкина-1b, вероятно, что КПN вовлекается в развитие воспалительных реакций [52,63].

Фермент участвует не только в процессинге энкефалинов, но и в их инактивации. Являясь основным ферментом ККС, он участвует в морфогенезе клеток, увеличении проницаемости сосудистой стенки, регуляции активности каскадных протеолитических систем плазмы крови: гемокоагуляции, фибринолиза, комплемента, развитии злокачественных новообразований [13,52].

Таким образом, КП N вносит вклад в регуляцию многих физиологических процессов и развитие патологических состояний. Поэтому, представляет интерес исследование активности фермента при онкологических заболеваниях в период химиотерапии.

1.3 Функционирование пептидергической системы при онкологических заболеваниях

Злокачественный рост характеризуется изменением активности и спектра ферментов. Ферментный спектр обусловлен локализацией, гистоцитогенезом и степенью дифференцировки опухоли. Если в дифференцированной опухоли ферменты соответствуют таковым данного органа или ткани, то при низкой степени дифференцировки активность и спектр ферментов значительно изменены. Большое значение придается ферментам в инвазии опухолевых клеток. В трансформированных клетках протеиназ синтезируется заметно больше, чем в нормальных клетках. При ряде злокачественных новообразований наблюдается выход пептидаз в межклеточное пространство и увеличение их активности. В сыворотке больных со злокачественными опухолями можно часто обнаружить увеличение активности одних ферментов и уменьшение других. Источником увеличения активности ферментов в сыворотке может являться усиленное выделение его опухолью в кровяное русло. При изучении локализации пептидазной активности в опухолях человека высокая пептидазная активность была выявлена в периферических отделах инвазивно растущих опухолей [19,26,27,41,59].

В процессе онкогенеза участвуют матриксные металлопротеазы (ММП). Транскрипция этих ферментов зависит от целого ряда факторов: цитокинов, факторов роста и некроза опухолей, химических агентов. Участие ММП в опухолевой трансформации, а также в процессах инвазии и метастазирования хорошо доказано in vitro и in vivo. Установлено, что экспрессия ММП коррелирует с деструктивными изменениями в матриксе и с туморогенным фенотипом клеток, а также зависит от вида опухоли и ткани. ММП могут участвовать в процессе канцерогенеза, воздействуя на различные пути передачи сигнала в клетке, основные компоненты соединительнотканного матрикса, на межклеточные взаимодействия, а также продуцируя различные биологически активные молекулы [35]. В опухолевых клетках может образовываться большое количество коллагеназы (представитель семейства ММП), мишенью действия которой является коллаген, представляющий собой барьер для распространения опухолевого процесса. Ингибитор её активности способен ограничивать инвазивность опухолевых клеток. Таким образом, коллагеназы ассоциированы с возникновением метастазирующего фенотипа клеток и играют ключевую роль в процессах инвазии и метастазирования. В процесс неопластической трансформации вовлечены лизосомные цистеиновые протеиназы. Ферменты деградируют многие белки и компоненты внеклеточного матрикса, осуществляют деструкцию ткани. Эти протеиназы осуществляют протеолиз короткоживущих белков, которые регулируют злокачественный рост [29,33,35,55,60].