Сложности появляются при наличии в растворе ионов Си + и других переходных металлов, являющихся потенциальными катализаторами окисления молекулярным кислородом. Их следует удалять или связывать в комплекс путем добавления хелатирующего агента этилендиаминтетрауксусной кислоты. Положение максимума поглощения зависит от рН и в кислых растворах смещается в область 245 нм. На основании величины поглощения при этой длине волны в растворе соляной кислоты и хлорида калия определяли содержание витамина С в безалкогольных напитках и некоторых лекарственных препаратах, где незначительны примеси других веществ. Часто бывает желательно определить в одном и том же растворе содержание дегидроаскорбиновой и L-аскорбиновой кислот. Дегидроаскорбиновая кислота поглощает в УФ-области при 220 нм, но величина молярного коэффициента экстинкции значительно ниже и составляет 720. Таким образом, в этом случае чувствительность спектрофотометрического анализа почти в 20 раз меньше, чем в случае L-аскорбиновой кислоты. Позже мы увидим, что этот факт имеет далеко идущие последствия при хроматографическом разделении L-аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот.

Для того чтобы преодолеть проблемы, связанные с присутствием в животных и растительных тканях веществ, поглощающих в УФ-области, проводился поиск реагентов, дающих специфические цветные реакции с L-аскорбиновой кислотой и(или) продуктами ее окисления. Титриметрический метод с использованием дихлорфенолиндофенола, описанный выше, был адаптирован для колориметрии. Для спектрофотометрического определения можно использовать и окрашенное 2,4-динитрофенилгидразиновое производное витамина. Обнаружено, что это же самое соединение образуется с дегидроаскорбиновой и 2,3-дикетогулоновой кислотами, являющимися продуктами окисления L-аскорбиновой кислоты (рис. 7.3). Эта реакция имеет широкое практическое применение для определения содержания дегидроаскорбиновой кислоты и известна под названием метода Роу. Он заключается во взаимодействии раствора дегидроаскорбиновой кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином в специфических условиях при 37°С в течение 4 ч, в результате чего образуется озазон — производное 2,3-дикетогулоновой кислоты. Эту же реакцию можно использовать и для определения содержания L-аскорбиновой кислоты, предварительно окислив ее до дегидроаскорбиновой кислоты над активированным углем (норит) раствором брома и т. п. При добавлении к озазону сильной кислоты образуется раствор красного цвета, поглощающий при 530 нм.

Основу для колориметрического и спектрофотометрического методов анализа создает также ярко-синий цвет продукта реакции L-аскорбиновой кислоты с соединениями диазония (рис. 7.4).

Альтернативный подход заключается в использовании флуоресценции продукта конденсации дегидроаскорбиновой кислоты с о-фенилендиамином. Облучение образующегося хиноксалина на длине волны 350 нм приводит к его флуоресценции при 427 нм. Обычно методика включает окисление L-аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой, и затем суммарное количество определяется спектрофлуорометрически.

4.5 Электрохимические методы

Электрохимические методы предоставляют возможность высокоселективного анализа с высокой точностью и воспроизводимостью; к тому же они очень просты в исполнении. Было предложено множество методик. Например, в таблетках поливитаминов, содержащих соединения Fe'-11-', витамин С был проанализирован методом дифференциальной пульсирующей вольтамперометрии на стеклянном углеродном электроде. Однако эти методики не нашли широкого применения, так как необходима большая работа по их

совершенствованию.

4.6 Хроматографические методы

Хроматографические методы дают самую большую надежду на преодоление основной проблемы, связанной с присутствием в смесях, содержащих витамин С, множества мешающих анализу веществ. Как мы уже видели, пока не существует методов, позволяющих четко и непосредственно определять небольшие количества L-аскорбиновой кислоты и(или) продуктов ее окисления в присутствии любых других соединений. Единственный удовлетворительный способ достижения специфичности заключается в хромато-

графическом отделении анализируемых соединений друг от друга, а также от остальных веществ.

Вплоть до относительно недавнего времени наиболее часто из хроматографических методов использовали обычно газожидкостную хроматографию (ГЖХ). Определить L-аскорбиновую кислоту непосредственно этим методом невозможно из-за ее нелетучести. Для того чтобы иметь такую возможность, была разработана длительная процедура превращения L-аскорбиновой кислоты в летучий триметилсилиловый эфир. Такой метод позволяет получать точные и воспроизводимые результаты, но из-за длительности предварительной подготовки образца он не так удобен, как разработанный недавно метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В настоящее время ВЭЖХ стала альтернативным способом быстрого определения самых разнообразных органических и неорганических соединений. Она часто находит применение в фармацевтической промышленности для анализа болеутоляющих и других препаратов. ВЭЖХ давно используется и для анализа витаминов.

Однако это не решает всех проблем в случае определения витамина С. Остается еще много сложностей, и метод не всегда удается использовать с одинаковой легкостью как для анализа всего разнообразия образцов, так и для определения малых концентраций.

Однако, когда применение метода ВЭЖХ возможно, он обычно дает надежные, точные и воспроизводимые результаты. Вопрос количественного определения разделенных веществ в ВЭЖХ требует наличия специфического физического свойства у витамина С (как у L-аскорбиновой кислоты, так и у продуктов ее окисления). Ко времени написания этой книги наиболее широкое

распространение получили детекторы, измерявшие поглощение в УФ- или видимой области спектра. Они позволяют определять нанограммовые количества L-аскорбиновой кислоты, но при определении дегидроаскорбиновой кислоты их чувствительность гораздо ниже из-за значительно более низкого молярного коэффициента экстинкции (см. выше). Остается проверить, нельзя ли повысить

эффективность анализа, используя детекторы другого типа, чувствительные к массе. Для ВЭЖХ обычно используют колонку с мелкопористым полимерным обратнофазовым сорбентом с развитой поверхностью, таким, как, например, PLRS-s 100A, при низких значениях рН водной подвижной фазы. Для этого подходит 0,2 М раствор NaH2PO4, который создает рН около 2,1, а также подавляет действие ионов металлов и дает хорошо забуференную подвижную фазу. Такой метод был использован для определения содержания L-аскорбиновой кислоты и продуктов ее окисления во фруктовых соках. В данной среде УФ-спектрофотометрический детектор, регистрирующий поглощение при 220 нм (при этой длине волны оба соединения имеют близкие молярные коэффициенты экстинкции), имеет удовлетворительную чувствительность. Типичная хроматограмма приведена на рис. 7.6.