Аффинная хроматография основана на принципе избирательного взаимодействия белков (или других молекул) с закрепленными на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (если выделяется какой-либо фермент) и т.д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному (закрепленному) лиганду, к нему присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляется подобранными специальными элюентами.

В гель-хроматографии в качестве стационарной фазы используют гель в виде крошечных гранул, так что такую стационарную фазу можно рассматривать как молекулярные сита. Гранулы геля изготовлены из полимера со сшитой структурой, подобной ситу. В качестве такого полимерного материала используются или сшитая агароза, или декстран (полисахарид), или сшитый полиакриламид. В водной среде полимерный материал сорбирует воду и набухает, превращаясь в гелеподобные гранулы, сохраняющие пористую структуру, причем размер пор такого набухшего материала определяется степенью сшивки полимера. Нанесенные на колонку соединения (в виде раствора в подвижной фазе) начинают взаимодействовать с гранулами геля, проникая в объем гранул через поры, что замедляет движение растворенного вещества по колонке. Молекулы небольшого размера лучше задерживаться на колонке, поскольку легче проникают в объем гранул и распределяются там. Молекулы с размерами, большими, чем размеры пор, совсем не будут проникать внутрь гранул, они первыми вымываются из колонки.

Результаты хроматографического разделения представляются графически в виде зависимости измеряемого свойства (поглощение в УФ области и т.п.) от объема элюата, вышедшего из колонки. Пики на таком графике соответствуют выходу индивидуальных белков. Если при разделении получается только один пик, это указывает на чистоту исходного препарата, нанесенного на колонку.

Свойство белков приобретать определенной величины заряд при данном значении рН раствора нашло широкое применение для их разделения методом электрофореза. Электрофорез основан на передвижении заряженной частицы в электрическом поле. Движение ее происходит в жидкой среде, которая удерживается инертным твердым носителем, например, полоской бумаги, гелевой пленкой из крахмала, полиакриламида, декстрона и т.д.

При постоянном напряжении движение заряженной молекулы белка определяется отношением заряда к ее размеру:

m =¦ (Q/r)

где Q-суммарный заряд белковой молекулы;

r-радиус молекулы.

С увеличением этого отношения подвижность молекулы растет. Так как каждый белок имеет свою определенную величину Q/r, скорость перемещения различных белков в электрическом поле будет различной. Электрофорез используется для разделения белков и определения их молекулярных масс.

Применение в определенной последовательности выше перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного очищения белков от низкомолекулярных примесей используются методы диализа, кристаллизации, гельхроматографии и ультрафильтрации.

Является ли полученный белковый препарат индивидуальным белком или смесью имеет важное значение. Всегда можно ожидать, что в составе изолированного белка есть примесь других белков; это может привести к неправильным выводам о свойствах исследуемого белка. Поэтому большое внимание уделяется оценке гомогенности – однородности белков. Критерием чистоты белков служат следующие показатели: получение белка в кристаллическом состоянии; дальнейшая неразделяемость при электрофорезе и ультрацентрифугировании; независимость растворимости от количества твердой фазы; постоянство аминокислотного состава; определенный молекулярный вес; для многих белков – постоянство специфических биологических свойств (ферментативная активность, гормональная активность и т.д.)

1.11 Классификация белков

Белки в зависимости от химического строения делят на простые и сложные. Простые белки при гидролизе распадаются только на аминокислоты. При гидролизе сложных белков наряду с аминокислотами образуется вещество небелковой природы – простетическая группа. Классификация простых белков основана на их растворимости.

Альбумины – водорастворимые белки с высокой гидрофильностью, выпадают в осадок при 100%-ом насыщении сульфатом аммония. К этим белкам относятся белок куриного яйца, белки зародыша семян злаковых и бобовых культур. Альбумин пшеницы называют лейкозин, гороха – легумелин. Альбумины содержат все незаменимые аминокислоты.

Глобулины – растворяются в солевых растворах, чаще всего для извлечения глобулинов используют 2 –10%-ый раствор хлорида натрия. Они осаждаются 50%-ым раствором сульфата аммония. Белки семян бобовых и масличных культур в основном представлены глобулинами; легумин – гороха и чечевицы, фазеолин – фасоли; глицин – соевых бобов. Многие альбумины и глобулины обладают ферментативным действием.

Проламины. Эта группа белков характерна исключительно для семян злаков. Эти белки растворяются в 60-80%-ом растворе этилового спирта. Эти белки содержат значительные количества пролина и глютаминовой кислот. Лизина они не содержат или содержат его в следовых количествах. Хорошо изучены проламины пшеницы – глиадины, ячменя – гордеин, кукурузы – зеин. Проламины – это комплексы белков различающиеся по составу и молекулярной массе.

Глютелины находятся, как правило, с проламинами. Растворяются они в щелочах (чаще 0,2%-ым NaOH). Глютелины не однородные белки, а смеси разных белков со сходными свойствами. Наиболее исследованы глютелин пшеницы, орезенин риса.

Глютенин и глиадин пшеницы образуют комплекс, который называют клейковиной. Клейковина муки влияет на структурно-механические свойства теста, а, следовательно на качество хлеба.

Протамины – самые низкомолекулярные белки. Встречаются эти белки в молоках рыб. На 2/3 эти белки состоят из аргинина, поэтому имеют основной характер. Протамины не содержат серы.

Гистоны – содержаться в хромосомах клеточных ядер, они участвуют в стабилизации пространственной структуры ДНК. Гистоны на 20-30% состоят из основных аминокислот. Из растворов их осаждают аммиаком.

Протеноиды – подгруппа нерастворимых фибриллярных белков животного происхождения. К ним относятся фиброин – шелка, кератин – волос, рогов, перьев, сухожилий и связок. Характерная особенность протеноидов – высокое содержание в них серы. Эти белки не гидролизуются пищеварительными ферментами.

Протеиды – сложные белки, в которых белок связан с веществом небелковой природы – простетической группой. В зависимости от химической природы простетической группы их делят на липопротеины, гликопротеины, хромопротеины, нуклеопротеины, фосфопротеины, металлопротеины.

В липопротеинах простетическая группа представлена каким-либо липидом. Эти белки входят в состав клеточных мембран, участвуют в структурной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлоропластов и т.д., а так же присутствуют в свободном состоянии.

Гликопротеины – в качестве простетической группы содержат углеводный компонент. Это могут быть глюкоза, монноза, N-ацетилглюкозамин, L-фукоза и т.д. Эти белки выполняют специфические функции: обеспечивают клеточную адгезию, молекулярное и клеточное узнавание, антигенную активность опухолевых клеток, оказывают защитное, гормональное, и антивирусное действие.