Отбор клеток с модифицированным геном также может производиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло-гичен соседней с сайтом интеграции последовательности модифицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируемой экзогенной ДНК.Метод позволяет обнаруживать присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди 50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать нужные клоны.

Направленное выключение генов-мишеней может быть достигнуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей,наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего образуется укороченный белок, незащищенный от действия клеточных протеаз.

Более совершенной является разработанная недавно техника двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последовательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мишени. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы. После трансфекции отбираются клетки позитивные по HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологичная рекомбинация с заменой одного из экзонов на инсертированный мини-ген HPRT. Факт такого встраивания доказывается при помощи ПЦР. На следующем этапе инсертированный HPRT мини-ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в который предварительно вносят интересующие исследователя мутации. При этом альтернативный вектор несет те же фланкирующие ДНК-последоваельности гена-мишени, что и первый (нокаутирующий) вектор. Клетки HPRT минус на этом, 2- м этапе с большой вероятностью будут нести гомологичную рекомбинацию встроенной конструкции мини-HPRT гена и альтернативного фрагмента исходного гена. Факт такой рекомбинации контролируется с помощью ПЦР. Таким образом, вместо обычного выключения функции гена, что достигается уже на 1-м этапе, данная технология позволяет вносить в структуру гена дикого типа различные,заранее спланированные изменения, в том числе и специфические мутации, аналогичные таковым при наследственных болезнях у человека. Следовательно, данный подход позволяет проводить более тонкое генетическое моделирование и исследовать особенности функции мутантного гена in vivo.

Для введения специфических мутаций в определенные экзоны гена используют, так называемые "hit & run" векторы (Hasty et al., 1991). Перспективным также представляется использование дрожжевых YAC-векторов, несущих полноразмерные кДНК-овые последовательности гена. Так как уровень гомологичной рекомбинации у дрожжей достаточно высок, в такие конструкции легко вводить специфические мутации и затем использовать их для трансфекции ЭСК и получения трансгенных животных 4.

Отбор клонов эмбриональных стволовых клеток, в которых произошла направленная модификация гена-мишени, в значительной степени, предопределяет успех всего комплекса работ по созданию модельной генетической линии. Однако, и дальнейшие этапы этой программы, включающие получение химерных трансгенных животных, идентификацию зародышевых трансмиттеров(химер, продуцирующих трансфецированные половые клетки) и селекцию гетерозиготных, а затем гомозиготных мутантнах особей, требуют большой квалификации, труда и времени. Осложняющим обстоятельством является то, что химерные животные нередко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутантных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в пренатальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем отбора и скрещивания гетерозигот.

Несмотря на огромные методические сложности и высокую стоимость, направленное получение моделей наследственных болезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло-гические процессы, развивающиеся в организме вследствие нарушений работы определенного гена, анализировать влияние специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарственные препараты и испытывать различные терапевтические подходы. Велика также роль генетических линий в разработке методов генной терапии.